Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm
- Triệu chứng và bệnh tích
Ở Việt Nam, trong khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 10 năm 2019, một số đàn vịt nuôi tại Hà Nội có biểu hiện sốt, giảm ăn, uống. Vịt bị mất điều hòa vận động, đi đứng xiêu vẹo. Vịt thịt chết với số lượng lớn trong vài ngày. Vịt đẻ giảm năng suất trứng đột ngột. Khi mổ khám vịt thấy có biểu hiện gan sưng, lách sưng, buồng trứng xuất huyết. Do ổ dịch ở vịt có thể do ghép nhiều nguyên nhân nên ngoài những đặc điểm trên, một số vịt còn có hiện tượng tiêu chảy phân màu xanh lá cây, gan hoại tử có phủ fibrin và túi mật sưng. Một số phác đồ can thiệp dịch đã được áp dụng gồm sử dụng kháng sinh (Ceftiofur, Gentamycin, Doxycyclin, Florphenicol), bổ trợ bằng điện giải và tiêm lại vacxin dịch tả vịt nhưng không thấy hiệu quả. Một số trang trại đã gửi mẫu xét nghiệm dịch tả vịt và cúm gia cầm nhưng kết quả đều âm tính. Theo thông tin ghi nhận từ biểu hiện lâm sàng và kết hợp với tình hình dịch tễ bệnh do virus Tembusu ở vịt trong khu vực, (Đặng Hữu Anh & cs, 2020) đã sử dụng phương pháp RT-PCR và chỉ ra sự có mặt của virus Tembusu ở những đàn vịt này.
Hình 1. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của vịt
dương tính với xét nghiệm phát hiện virus Tembusu
Ghi chú: A: vịt có tỷ lệ mắc cao, mất điều hòa vận động, bại liệt; B: Phân xanh lá cây; C: Lách sưng; D: Túi mật sưng; E: Buồng trứng xuất huyết; F: Gan sưng
- Kết quả RT- PCR phát hiện virus Tembusu
Mẫu vịt ốm (2 – 7 tháng tuổi) có triệu chứng nghi ngờ do virus Tembusu gây ra, thu thập tại các trang trại ở huyện Thạch Thất và Gia Lâm (Hà Nội). Mẫu gộp phủ tạng của vịt bệnh bao gồm: não, tim, phổi, gan, lách, buồng trứng.
– Hóa chất dùng tách và tinh sạch ARN tổng số gồm: (i) TRIzol reagent (15596026, Invitrogen); (ii) chloroform (102445, Merck Millipore); (iii) 2-Propanol (109634, Merck Millipore); (iv) cồn 70%; (v) nước cất đã xử lý bằng 0,1% diethylpyrocarbonate (IBS-BW004B, iNtRON Biotechnology).
– Tổng hợp cDNA được thực hiện bằng: (i) random hexamers (N8080127, Invitrogen) và (ii) kit M-MLV Reverse Transcriptase (28025013, Invitrogen)
– Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản ứng PCR: (i) 2X PCR Master mix solution (i-MAX-II, 25266, iNtRON Biotechnology); (ii) cặp mồi đặc hiệu gen NS5B của virus được lấy theo nghiên cứu đã công bố (Liu & cs, 2012), với thông tin ở bảng 2.5.
Bảng 1. Trình tự mồi của phản ứng RT- PCR xác định virus Tembusu
|
Tên mồi |
Trình tự mồi (5’ – 3’) | Kích thước (bp) |
| NS5f | TTTGGTACATGTGGCTCG | 350 |
| NS5r | ACTGTTTTCCCATCACGTCC |
- Kết quả phân tích mối liên hệ di truyền của các chủng virus Tembusu
Trình tự gen NS5B thường được dùng trong nghiên cứu mối liên hệ di truyền của giống Flavivirus (Kuno & cs, 1998) trong đó virus Tembusu. Dựa vào trình tự một phần gen NS5B (350 nucleotide), cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng với 3 chủng của Việt Nam và 137 trình tự tương ứng công bố trên GenBank. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại trong nghiên cứu này giống với công bố trước đây (Yu & cs, 2018) khi cũng chỉ ra có 5 nhóm di truyền của Tembusu virus với giá trị bootstrap > 90% (hình 2.28).
Dựa vào đặc điểm phân nhóm, các chủng Tembusu virus của Trung Quốc tạo thành 2 nhánh lớn riêng biệt (Chinese strains I, II) và tách biệt với chủng virus phát hiện được ở Thái Lan và Malaysia. Cũng dựa vào đặc điểm trên, 3 chủng virus Tembusu trong nghiên cứu này được xếp vào nhóm Thailand strains và gần gũi (về trình tự gen NS5B) với chủng virus phát hiện ở Thái Lan năm 2013 (KR061333).
Kết quả phân tích trình tự gen cũng cho thấy, phản ứng RT-PCR đã được tối ưu và đạt độ tin cậy cao trong chẩn đoán bệnh do virus Tembusu gây ra. Trong số những mẫu dương tính với phản ứng RT-PCR, có cả mẫu của đàn vịt thịt bị bệnh ở giai đoạn 2 tháng tuổi chứng tỏ Tembusu virus cũng có khả năng gây nhiễm cho vịt thịt ở Việt Nam.
Hình 2.28. Cây phát sinh chủng loại của virus Tembusu
Ghi chú: một phần trình tự NS5B (350 nucleotide) được dùng để xây dựng cây, giá trị bootstrap được trình bày cho các nhánh chính. virus Tembusu được phân thành 5 nhóm chính dựa vào nghiên cứu của Yu và cs 2018. Nhánh của cây phát sinh chủng loại dẫn tới 3 chủng của Việt Nam (mũi tên) được đánh màu xanh
English