NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ ĐÔNG LẠNH NHANH PHÔI BÒ IN VITRO
FACTORS AFFECTING THE EFFICIENCY OF BOVINE IN VITRO EMBRYO VITRIFICATION
Nguyễn Thị Ngọc Anh, Nguyễn Đức Trường, Nguyễn Thị Thu Trang, Nguyễn Văn Thành, Đỗ Thị Kim Lành*
Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Tính cấp thiết
Sự phát triển của công nghệ hỗ trợ sinh sản nói chung và kỹ thuật đông lạnh nói riêng đã đem lại nhiều tiềm năng ứng dụng có ý nghĩa không chỉ về kinh tế mà cả trong nghiên cứu khoa học. Với nhiều ưu điểm nổi bật, đông lạnh nhanh bằng thuỷ tinh hoá đã trở thành phương pháp thay thế cho đông lạnh chậm-giải đông nhanh truyền thống. Nhiều quy trình đông lạnh nhanh khác nhau đã được đề xuất nhằm mục đích tối ưu hóa tỷ lệ sống của phôi bào bao gồm phát triển các dụng cụ khác nhau để giảm khối lượng dung dịch thủy tinh hóa và để tăng tốc quá trình (Vajta &cs., 1998; Siqueira Filho &cs., 2011; Villamil &cs., 2012; Do &cs., 2014). Ngoài ra, thành phần các chất bảo vệ lạnh nội bào như ethylene glycol (EG) và dimethylsulfoxide (DMSO) cũng được thay đổi nhằm tạo ra một hỗn hợp hiệu quả để thâm nhập vào các tế bào và mô (Vajta &cs., 1996, 1998; Yokota &cs., 2000; Rodrigues &cs., 2004a,b; Madeira &cs., 2014).
Ở nước ta trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu được triển khai nhằm nhân nhanh đàn bò để thực hiện “Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020” do Thủ tướng chính phủ đề ra (16/1/2008). Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn gặp khó khăn do bò là động vật đơn thai, thời gian mang thai kéo dài, ảnh hưởng đến hiệu quả nhân nhanh và cải tạo giống. Việc ứng dụng công nghệ cấy truyền phôi trên bò là bước tiến quan trọng giúp nhân nhanh đàn bò, đồng thời khai thác được ưu thế di truyền của cả bò đực giống và bò cái giống. Tuy nhiên, hiệu quả cấy truyền phôi phụ thuộc vào sự đồng pha giữa tuổi phôi và giai đoạn động dục của bò nhận. Vì vậy, phôi bò sản xuất ra thường được yêu cầu đông lạnh và bảo quản trong nito lỏng để luôn sẵn sàng vào thời điểm cấy phôi thích hợp trên bò nhận phôi. Tuy nhiên, chất lượng phôi bò sau giải đông chưa cao, do đó việc nghiên cứu nâng cao hiệu quả bảo quản phôi bò bằng phương pháp thủy tinh hóa là việc làm cấp thiết. Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh, trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass- like). Hiện nay, thủy tinh hóa là phương pháp tối ưu nhất được sử dụng để đông lạnh phôi do tính tiết kiệm về mặt thời gian, không tốn chi phí về mặt thiết bị đồng thời cũng không hình thành tinh thể đá làm tổn thương tế bào như phương pháp đông lạnh chậm (Mogas, 2019).
Mục đích nghiên cứu:
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm ra môi trường nuôi thành thục trứng, môi trường thụ tinh ống nghiệm, nồng độ tinh trùng thích hợp và điều kiện nuôi phôi tối ưu nhằm nâng cao hiệu quả tạo phôi bò trong phòng thí nghiệm, đồng thời so sánh hiệu quả hai môi trường đông lạnh nhanh là TCM-199+BSA và DPBS+FBS qua đó nâng cao hiệu quả đông lạnh phôi góp phần tạo nguồn nguyên liệu phôi bò chất lượng cho sản xuất thương mại và các nghiên cứu chuyên sâu.
- Phương pháp nghiên cứu
2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục trứng đến tỷ lệ thành thục của trứng bò in vitro.
Tế bào trứng loại A và B thu được có 2 đến 4 lớp tế bào cận noãn (cumulus) bao quanh trứng, các lớp tế bào cận noãn này dày, đều đặn, đồng nhất và liên kết chặt chẽ với nhau, nguyên sinh chất của trứng đồng đều, toàn bộ trứng nhìn trong và đầy đặn, được nuôi trong môi trường TCM199 hoặc môi trường BO-IVM. Khoảng 50 tế bào trứng loại A và B được nuôi trong 500 ul môi trường nuôi trứng bao gồm TCM19 chứa muối Earle’s (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bổ sung 0.6 mM cysteine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.02 AU/ml follicle stimulating hormone (FSH – Kyoritsuseiyaku Co., Tokyo, Japan), 5% huyết thanh bê (FBS; Invitrogen), và 50 µg/ml gentamicin (Sigma-Aldrich) hoặc trong môi trường BO-IVM trong 22 giờ, nuôi trong đĩa 4 giếng (Nunc A/S, Roskilde, Denmark). Quá trình nuôi trứng được thực hiện ở 38.5°C trong tủ cấy chứa 5% CO2, độ ẩm không khí bão hoà (Mori và cs.,2002). Sau 22 giờ nuôi cấy, các tế bào trứng được loại bỏ màng tế bào cận noãn (tế bào cumulus) sử dụng dung dịch Hyaluzonidaza (150IU) và tác động cơ học sử dụng pipet thuỷ tinh. Sau đó tế bào trứng được nhuộm bằng thuốc nhuộm orcein và đánh giá các giai đoạn phát triển của nhân dưới kính hiển vi soi nổi có độ phóng đại 40 lần.
2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ tinh trùng đến tỷ lệ thụ tinh của trứng bò sau IVM (In vitro maturation) và khả năng phát triển của phôi bò sau IVF (In vitro fertilized)
Trứng bò sau IVM được thụ tinh trong ống nghiệm sử dụng tinh bò đông lạnh ở nồng độ 1, 2 hoặc 5×106 tinh trùng/ml. Quá trình thụ tinh được thực hiện trong 6 giờ, ở 38.50C, 5% CO2, độ ẩm không khí bão hoà. Sau thời gian thụ tinh, một phần tế bào trứng sẽ được nhuộm orcein để đánh giá tỷ lệ thụ tinh, phần còn lại được chuyển sang môi trường nuôi phôi IVC để đánh giá khả năng phát triển và hình thành phôi nang.
2.3 Đông lạnh phôi bò bằng phương pháp thuỷ tinh hoá; đánh giá hiệu quả môi trường đông lạnh nhanh
Phôi bò sau khi phát triển đến giai đoạn phôi nang sớm sẽ được tiến hành đông lạnh phôi bằng phương pháp làm lạnh nhanh (phương pháp thủy tinh hóa). Môi trường đông lạnh nhanh là DPBS+ FBS hoặc TCM199+BSA
3.Kết quả chính
Không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ tế bào trứng thành thục khi nuôi trong môi trường BO-IVM hoặc TCM-199. Trứng bò thụ tinh trong ống nghiệm với nồng độ 2 × 106 tinh trùng/ml trong 6 giờ cho tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ phôi nang cao nhất. Đông lạnh và giải đông phôi bò trong môi trường đông lạnh nhanh DPBS+FBS và TCM199+BSA cho tỷ lệ phôi sống sau giải đông lần lượt là 92,96 % và 82,71 %, tuy nhiên không có sự khác biệt thống kê về tỷ lệ này giữa hai môi trường. Tỷ lệ phôi thoát màng sau giải đông của môi trường TCM199+BSA đạt 54 % cao hơn (p<0,05) so với tỉ lệ này ở môi trường DPBS+FBS là 28,8 %. Với nhóm phôi chỉnh gene, số lượng phôi sống sau giải đông đạt 96,03 % so với 88,82 % ở nhóm phôi IVF. Tỷ lệ phôi sống sau giải đông cũng bị ảnh hưởng bởi yếu tố nguồn gốc của tế bào trứng.
- Kết luận
Đông lạnh và giải đông phôi bò trong môi trường đông lạnh nhanh DPBS+FBS và TCM199+BSA cho tỷ lệ phôi sống sau giải đông lần lượt là 92,96 % và 82,71 %, tuy nhiên không có sự khác biệt thống kê về tỷ lệ này giữa hai môi trường. Tuy nhiên, tỉ lệ phôi sống thoát màng sau giải đông của môi trường TCM199+BSA đạt 54 % cao hơn đáng so với tỉ lệ này ở môi trường DPBS+FBS là 28,8 %
Xung điện chỉnh sửa gen không làm ảnh hưởng đến tỷ lệ phôi sống sau giải đông mà còn làm tăng khả năng thoát màng của phôi sau giải đông. Với nhóm phôi chỉnh gene, số lượng phôi sống sau giải đông đạt 170/180 phôi đông lạnh, chiếm 96,03 % so với 88,82 % ở nhóm phôi thường.
Tỷ lệ phôi sống sau giải đông cũng bị ảnh hưởng bởi yếu tố nguồn gốc của tế bào trứng. Với những tế bào trứng được thu từ bò H.mong cho tỉ lệ phôi sống sau giải đông đạt 96,07 % cao hơn đáng kể tế bào trứng thu từ nhóm bò Sữa và bò Úc (89,2 % và 79,54 %)
Từ khóa: phôi nang, đông lạnh nhanh, phôi bò in vitro.
Link bài báo: https://tapchi.vnua.edu.vn/so-9-2023/
Bảng 1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự thành thục của trứng bò.
| Môi trường | Số trứng | GVBD (%) | Trứng thành thục |
| TCM 199 | 88 | 86 (97,65 ± 2,35) | 68 (78,85 ± 3,78) |
| BO-IVM | 120 | 118 (98,8 ± 0,78) | 104 (83,42 ± 5,67) |
Số lần nhắc lại thí nghiệm n=5
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê P < 0.05
Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ tinh trùng đến tỷ lệ phôi phân chia và số lượng phôi nang (ngày thứ 7):
| Nồng độ tinh (triệu/ml) | Số trứng (n) | Phân chia (%) | Phôi nang |
| 1 | 216 | 88 (41,83 ± 6,31)a | 24 (11,26 ± 1,85)c |
| 2 | 203 | 142 (69,87 ± 4,07)b | 59 (29,1 ± 4,11)d |
| 5 | 174 | 82 (47,46 ± 3,27)a | 35 (20,53 ± 1,49)e |
Số lần nhắc lại thí nghiệm là 5 – 6 lần
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê P < 0,05.
Bảng 3. Khả năng phát triển của phôi bò sau giải đông
| Môi trường | Số phôi | Phôi sống sau giải đông (%) | Phôi thoát màng (%) |
| DPBS+FBS | 367 | 332 (92,96±1,38) | 85 (28,8±3,2)a |
| TCM199+BSA | 45 | 39 (82,71±6,74) | 25 (54±13,25)b |
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê P < 0,05.
Bảng 4. Tỷ lệ phôi sống sau giải đông theo nhóm phôi
| Nhóm phôi | Số phôi | Phôi sống sau giải đông (%) | Phôi thoát màng (%) |
| Phôi chỉnh sửa gene | 180 | 170 (96,03±1,55)a | 50 (32,9±4,75) |
| Phôi IVF | 232 | 201 (88,82±2,14)b | 60 (28,27±4,19) |
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê P < 0,05.
Bảng 5. Ảnh hưởng của nguồn gốc tế bào trứng đến khả năng sống sót của phôi sau giải đông
| Nguồn gốc | Số phôi | Phôi sống sau giải đông (%) | Phôi thoát màng (%) |
| Bò H.mong | 222 | 211 (96,07±1,42)a | 74 (34,56±4,35) |
| Bò sữa | 149 | 129 (89,2±2,59)b | 31 (26,72±4,9) |
| Bò Úc | 41 | 31 (79,54±5,73)b | 5 (18,89±11,6) |
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê P < 0,05.
English