• Home /
  • Tin tức khoa học
  • / XÁC ĐỊNH CÁC BIỂU HIỆN TRIỆU CHỨNG CỦA MÈO MẮC BỆNH VIÊM PHÚC MẠC TRUYỀN NHIỄM (FIP) VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ
Khoa học công nghệ, Tin tức khoa học

“Vai trò của thụ thể porcine CD163 và porcine Sialoadhesin (pSn) trong quá trình nhân lên của virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome) trên các tế bào cảm thụ”.

Ngày đăng: by Khoa Thú y

“Vai trò của thụ thể porcine CD163 và porcine Sialoadhesin (pSn)  trong quá trình nhân lên của virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome) trên các tế bào cảm thụ”.

Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm

Tóm tắt. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome) có xu hướng tăng thích nghi cao đối với các tế bào đại thực bào, đặc biệt là các đại thực bào phế nang lợn (porcine alveolar macrophages – PAMs). Cho đến nay người ta đã biết được nhiều thụ thể màng  trên tế bào đại thực bào phế nang lợn giúp cho virus PRRS nhân lên. Những tiến bộ gần đây trong việc nghiên cứu sự xâm nhập của PRRSV (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) vào các tế bào chủ đã dẫn đến việc xác định một loạt các thụ thể tế bào và các chất trung gian tham gia vào quá trình này. Cho đến nay, một số thụ quan quan trọng của PRRS đã được báo cáo; chúng bao gồm sulphat heparan (HS), vimentin, sialoadhesin (SN, CD169), CD151 và CD163 (SRCR, cysteine-rich scavenger receptor). Sự gắn kết sớm của PRRSV với tế bào chủ thông qua trung gian là HS. Sau đó, SN liên kết với các axit sialic thông qua lãnh vực đầu N-terminal kết nối axit sialic của nó giúp virus hấp thụ vào tế bào đại thực bào phế nang lợn (PAMs); SN một mình cũng có thể đảm nhận 2 vai trò là gắn kết và hấp thụ virus vào trong tế bào. CD151 có thể được tham gia sự kết hợp của lớp vỏ virus với các hạt nội bào (endosome), nhưng cơ chế chính xác vẫn chưa được biết đến. Ngoài ra, CD163, thụ thể liên kết của phức hợp haptoglobin-hemoglobin, đã được xem như là một thụ thể trung gian thiết yếu trong nhiễm PRRSV vào tế bào Marc-145 và có thể chuyển đổi các tế bào không cho phép thành các tế bào cho phép PRRSV trong quá trình cởi vỏ virus. Hiểu được vai trò của các thụ thể PRRSV sẽ giúp tạo ra những tế bào cho phép  PRRSV nhân lên; thiết kế các thuốc thử chống virus mới. Từ khóa: Virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome); thụ thể; tế bào cảm thụ, đại thực bào phế nang lợn. The role of porcine CD163 and porcine Sialoadhesin (pSn) receptors in PRRSV (reproductive and respiratory syndrome virus)  replication on susceptible cells. Abstract It has been reported that Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)  has a high tropism for cells of the monocyte macrophage lineages, for instance porcine alveolar macrophages (PAMs). Recent progress in studying the entry of  PRRSV into host cells has led to the identification of a series of cellular receptors and entry mediators. So far, several important receptors of PRRSV have been reported and they include heparan sulphate (HS), vimentin, sialoadhesin (SN, CD169), CD151, and CD163 (SRCR, cysteine-rich scavenger receptor). The early attachment of PRRSV is mediated via HS. Subsequently, SN connects the sialic acids with its N-terminal sialic acid-binding domain, and finally, the virus internalizes into the PAMs.As far as we know, SN alone is sufficient for both PRRSV attachment and internalization.CD151 may be involved in fusion of the viral envelope and the endosome, but the precise mechanism is yet unknown.  In addition, CD163, the binding receptor of the haptoglobin–haemoglobin complex, has been discussed as an essential mediator in PRRSV’s infection of Marc-145, and may be able to convert non-permissive cells into PRRSV permissive cells during uncoating. So that, porcine sialoadhesin (pSN) and CD163 have been identified as key viral receptors on porcine alveolar macrophages (PAMs), a main target cell infected by PRRSV. Understanding the role of PRRSV receptors will help to make non-permissive cells susceptible to PRRSV; designing the new anti – viral reagents. Key words: Virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome); receptors; susceptible cells; porcine alveolar macrophages (PAMs).  
  1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Virus PRRS xuất hiện ở tất cả các khu vực chăn nuôi lợn trên thế giới và có rất ít trường hợp ngoại lệ. Tuy nhiên, ở châu Âu, có một số quốc gia hiện không có PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS)  đó là Thụy Sĩ, Thụy Điển, Na Uy và Phần Lan. Hiện nay có 2 kiểu gen của PRRSV (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) chính được công nhận là Châu Âu (Nhóm I) có tên gọi là Lelystad và Bắc Mỹ (Nhóm II) có tên gọi là VR2332. Tất cả các nghiên cứu đều chỉ ra sự đa dạng về kiểu gen của các chủng virus PRRS. Hầu hết các nước ở châu Âu chỉ có 1 chủng thuộc týp 1, nhưng vẫn có 1 số nước có cả chủng thuộc týp 1 và týp 2. Mặc dù một số chủng týp 1 đã được tìm thấy ở một số khu vực nhưng, virus PRRS týp 2 vẫn chiếm ưu thế ở Bắc Mỹ và hầu hết các quốc gia châu Á. Virus PRRS, thuộc bộ Nidovirales, họ Arteriviridae và chi Arterivirus (Dokland 2010). Virus PRRS có hình cầu, có vỏ bọc ngoài với đường kính của virion vào khoảng 45 – 55 nm, nucleocapsid có đường kính từ 30 – 35 nm, là ARN virus với bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dương, có những đặc điểm chung của nhóm Arterivirus. Sợi ARN này có kích thước khoảng 15 kilobase, có 10 ORF (open reading frame) ORF1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b và ORFs 3 đến 7, bao gồm ORF5a (Johnson và cộng sự, 2011; Robinson và cộng sự, 2013) mã hoá cho 9 protein cấu trúc. Tuy nhiên, có 6 phân tử protein chính có khả năng trung hoà kháng thể bao gồm 4 phân tử glycoprotein, trong đó GP5 glycoprotein là glycoprotein phong phú nhất trên bề mặt virion, trong khi các glycoprotein GP2a, GP3 và GP4, mã hoá bởi ORF2a, ORF3 và ORF4, được đặt tên là các glycoprotein vỏ bao nhỏ, vì chúng có mặt trên bề mặt virion với lượng ít hơn (Meulenberg và cộng sự, 1995; Meulenberg và Petersen-den Besten 1996); 1 phân tử protein màng (M) và 1 protein vỏ nhân virus (N). PRRSV có ái lực đặc biệt với tế bào đại thực bào đặc biệt là đại thực bào ở phổi do đó nó có thể nhân lên khi nuôi cấy trên môi trường tế bào đại thực bào phế nang (porcine alveolar macrophages – PAMs) hoặc các tế bào dòng như (CL-2621, MARC-145, tế bào thận khỉ Châu Phi MA-104) (Kim và cộng sự, 1993). Tuy nhiên, PRRSV chủ yếu sao chép trong các tế bào đại thực bào phế nang của lợn PAMs. Trên thực tế,  sự truyền nhiễm của PRRSV vào các tế bào đích là một quá trình tương tác giữa virus với các  thụ thể trung gian. Cho đến nay, đã xác định được một số thụ thể của PRRSV trên tế bào đích quan trọng như heparin sulfat (HS), sialoadhesin (Sn), CD163, CD151 và vimentin. Những thụ thể này đóng vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm của PRRSV vào tế bào đích vì chúng có thể liên quan đến sự gắn kết của virus, hấp phụ hoặc cởi vỏ capsit. Trong đó Sn tham gia vào việc liên kết giữa tế bào với virus sau đó giúp tế bào hấp phụ virus (Vanderheijden và cộng sự 2003, Delputte et al., 2011); CD163 chịu trách nhiệm cho việc cởi bỏ lớp vỏ capsit của virus đã nhiễm vào trong tế bào đích (Van Gorp và cộng sự, 2010, Welch and Calvert 2010). Mỗi thụ thể được đặc trưng bởi sự phân bố riêng của nó trong các tế bào khác nhau, chức năng trong giai đoạn nhiễm virus và mô hình tương tác với các thành phần virus. Hơn nữa, nếu chỉ có một thụ thể thì không thể hoàn thành toàn bộ quá trình truyền nhiễm virus vào trong tế bào đích được. Vì vậy, các  ái lực liên kết chung của các thụ thể này rất quan trọng trong suốt quá trình nhiễm virus. Ngày nay, sự hiểu biết về vai trò của thụ thể PRRSV trong việc truyền nhiễm virus và cơ chế phân tử của sự tương tác giữa PRRSV và thụ thể của nó vẫn còn hạn chế mặc dù đã có những nghiên cứu sâu rộng. Trong bài tổng quan này, chúng tôi thảo luận vai trò quan trọng của hai thụ thể trên tế bào cảm thụ trong quá trình nhiễm PRRSV là CD163 và Sn (CD169), cơ chế phân tử của sự tương tác giữa các thụ thể với các protein hoặc gen PRRSV. Hiểu được vai trò của các thụ thể PRRSV sẽ giúp tạo ra những tế bào cho phép  PRRSV nhân lên; thiết kế các thuốc thử chống virus mới. Sialoadhesin (Sn): Sialoadhesin (Siglec-1, CD169, hoặc Sn),  ban đầu được xác định là thụ thể hồng cầu cừu phụ thuộc axit sialic (sialic acid-dependent sheep erythrocyte receptor – SER) có trên tế bào tủy xương của chuột, và hiện nay nó cũng được xác định có trên chuột, người và lợn (Peter L. Delputte và cộng sự, 2011). Nó là một protein màng bám dính axit sialic (TM) thuộc họ axit sialic bám dính miễn dịch gắn lectins (sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins – SIGLEC) (Crocker PR, Varki A; 2001). Sn chỉ được thể hiện trên các tập con cụ thể của quần thể đại thực  bào và được tìm thấy chủ yếu ở lá lách, hạch bạch huyết, tủy xương, gan, ruột kết và phổi (Hartnell A và cộng sự., 2001; Crocker PR và cộng sự., 1991). Hầu hết các Siglecs đều có một hoặc nhiều gốc tyrosine bào tương xuyên suốt (cytosolic tyrosine-based motifs) liên quan đến việc truyền tín hiệu  hoặc thực bào; tuy nhiên Sn lại thiếu gốc tyrosine bào tương xuyên suốt ở phần đuôi tế bào chất ngắn (O’Reilly MK, Paulson JC.,2009). Sn gồm có 17 lãnh vực globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig), một đầu tận cùng lãnh vực N cần thiết cho liên kết các axit sialic, một lãnh vực TM và một đuôi tế bào chất ngắn (Durocher và cộng sự, 1975). . Bằng cách tương tác với các phân tử axit sialic nằm trên bề mặt các mầm bệnh và các tế bào khác, chẳng hạn như các monocytes và một số tế bào T gây độc tế bào, Sn tham gia vào rất nhiều phản ứng miễn dịch thích nghi, như quá trình phân tích và trình diện kháng nguyên; kích hoạt các tế bào B và T (Durocher và cộng sự, 1975, Martinez-Pomares và Gordon 2012, O’Neill và cộng sự, 2013).PAMs (Porcine alveolar macrophages) là các tế bào mục tiêu chính cho PRRSV xâm nhập, và Sn được biểu hiện trên bề mặt tế bào PAMs. Hơn nữa, axit sialic, phối tử của thụ thể Sn, được biểu hiện trên bề mặt hạt virus trong tất cả các kiểu gen PRRSV. Điều này có nghĩa là Sn có thể đóng vai trò quan trọng trong việc lây nhiễm PRRSV. Trên thực tế, khi sử dụng các tế bào nuôi cấy in vitro thực nghiệm, Sn của lợn (Porcine Sn – pSn) đã được chứng minh là một thụ thể khác của PRRSV chịu trách nhiệm cho sự gắn kết và thực bào, nhưng không chịu trách nhiệm cởi bỏ vỏ virus. Sự lây nhiễm của PRRSV lên tế bào PAMs có thể bị chặn lại bằng cách bổ sung kháng thể đơn dòng đặc hiệu chống lại Sn, ví dụ như kháng thể đơn dòng 41D3 (Van Gorp và cộng sự 2010). Tế bào thận lợn-15 (PK15) là dòng tế bào âm tính với Sn và có khả năng đề kháng với sự xâm nhập của PRRSV. Các tế bào không cho phép PRRSV nhân lên như vậy có thể trở nên nhạy cảm với sự lây nhiễm PRRSV ngay cả với các chủng Châu Âu hoặc Bắc Mỹ, các virus có thể gắn kết và được các tế bào này hấp thụ vào trong khi được chuyển nhiễm với gene Sn (Vanderheijden và cộng sự, 2003, Welch and Calvert 2010). Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu Vanderheijden (Vanderheijden và cộng sự, 2003) đã không quan sát thấy sự cởi bỏ lớp vỏ của các hạt virus và nhân lên. Hơn nữa, xử lý PAMs với kháng thể đơn dòng mAbs 41D3 đặc hiệu pSn có thể làm giảm đáng kể sự hình thành thực bào và ngăn chặn sự lây nhiễm PRRSV, nhưng không tác động nhiều đến các chức năng phản ứng lại kích thích của tế bào, như khả năng sống sót của tế bào, kiểu sản xuất oxy / nitơ tác động trở lại, biểu hiện phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MHC lớp I và MHC lớp II trên bề mặt tế bào và sản xuất cytokine. Điều này có nghĩa là Sn có thể được sử dụng làm mục tiêu tiềm năng cho các liệu pháp miễn dịch đối với sự lây nhiễm PRRSV (Vanderheijden và cộng sự, 2003). Gần đây, người ta đã thông báo rằng thụ thể Sn hòa tan hợp nhất với phần Fc của IgG ở người có thể vô hiệu hóa nhiễm PRRSV (Van Breedam và cộng sự, 2013). Chen và cộng sự 2014 báo cáo rằng Sn hòa tan cùng với thụ thể CD163 có thể ngăn chặn sự lây nhiễm của PRRSV lên tế bào PAMs thông qua sự ức chế bổ sung. Tuy nhiên, (Prather và cộng sự, 2013) đã chứng minh một cách đáng ngạc nhiên rằng Sn không phải làthụ thể bắt buộc cho sự gắn  kết với PRRSV và hấp thụ virus. Họ rút ra kết luận này sau khi tiến hành các thử nghiệm trên cơ thể sống; những con lợn có kiểu gene Sn khác thường được tạo ra bằng cách loại bỏ một phần của exon 1 và tất cả exon 2 và 3 cho thấy không có bất kỳ sự thay đổi đáng kể nào như tiến triển bệnh lâm sàng, mô bệnh học và chứng nhiễm trùng máu sau khi  thử thách PRRSV so với các lô đối chứng. Biểu hiện Sn trên bề mặt của PAM đã bị chặn, và mức độ biểu hiện CD163 không thay đổi đáng kể trong những con lợn có kiểu gene Sn khác thường này. Các hệ thống thí nghiệm khác nhau được thực hiện để phát hiện các thụ thể PRRSV đã trả lời khác nhau về tầm quan trọng của Sn trong nhiễm PRRSV. Do đó, cần có nhiều dữ liệu hơn, đặc biệt là các thí nghiệm trên cơ thể sống để làm rõ vai trò của Sn trong PRRSV (Prather và cộng sự, 2013).Các lãnh vực chính và các axit amin liên quan đến tương tác pSn với PRRSV đã được tìm thấy. Trong đó có lãnh vực đầu N miễn dịch của Sn là vị trí liên kết với axit sialic (Delputte và cộng sự., 2011). Hoạt động gắn kết của đầu pSn N-terminal với 150 axit amin rất quan trọng, không thể thiếu, và sự biểu hiện của đầu N-terminus là đủ để cho phép quá trình bám dính với  PRRSV và thực bào virus. Các tế bào PK không cho phép PRRSV xâm nhập có thể bị nhiễm virus sau khi biểu hiện đầu N-terminal với 150 amino axit (bao gồm cả 19 amino axit peptide tín hiệu) của pSn (Jiang và cộng sự, 2013). Gần đây, (Chen và cộng sự, năm 2014) cho thấy rằng Sn4D-Fc hòa tan (the four N-terminal Ig-like domains of pSn fused with porcine Fc) có thể liên kết với PRRSV và ức chế sự nhân bản của virus thông qua cạnh tranh với Sn bề mặt tế bào trên PAMs. Các thí nghiệm đột biến tại chỗ xác nhận rằng dư lượng axit amin S107 của pSn nên là điểm then chốt cho việc pSn gắn với acid sialic PRRSV. S107 có thể hình thành hốc đặc biệt và liên kết hydro để tạo thuận lợi và tăng mối tương tác giữa pSn và PRRSV. Các vị trí khác, bao gồm W2, Y44, S45, R97, R105, W106 và V109 cũng có thể tham gia vào quá trình này. Đã có báo cáo rằng nếu R97 bị đột biến sang E97, thì quá trình xâm nhiễm của PRRSV được ghi nhận là bị chặn lại (Jiang và cộng sự 2013).Các axit sialic trên bề mặt của protein PRRSV GP5 đã được xác định là phối tử chủ chốt chịu trách nhiệm liên kết với pSn trên lớp vỏ bề mặt của virut (Van Breedam và cộng sự, 2013). Sử dụng các phân tử Sn hòa tan (pSn gắn Fc hòa tan, pSn4D-Fc), Van Breedam et al. (2013) cho thấy rằng nó là các axit sialic trên GP5 đóng vai trò như phối tử Sn trong suốt quá trình PRRSV nhập vào các tế bào chủ bao gồm cả PAMs và các tế bào Marc-145. Hai glycoprotein trên vỏ bề mặt khác là GP3 và GP4 đã bị loại trừ để có thể hoạt động như một phối tử liên kết với Sn, mặc dù các phân tử axit sialic cũng nằm trên bề mặt virus. Trong thực tế, protein GP5 và M liên kết disulfid với nhau tạo thành các heterodimers trong các hạt PRRSV. Sử dụng các Sialidase để xử lý PRRSV, loại bỏ axit sialic từ protein GP5 làm mất liên kết giữa M / GP5 với pSn4D-Fc (Van Breedam và cộng sự 2013). Ngoài ra, các axit sialic có mặt trên các tế bào đích có thể gây trở ngại cho sự xâm nhiễm PRRSV bằng cách cạnh tranh với axit sialic trên PRRSV liên kết với thụ thể Sn. Delrue et al. (2010) báo cáo rằng nếu các tế bào được xử lý lần đầu với neuraminidase để loại bỏ các cis – axit sialic có mặt trên bề mặt tế bào, chất gây cản trở tương tác giữa PRRSV với Sn, thì số lượng tế bào nhiễm với PRRSV tăng lên rất nhiều. Vì vậy, phức hợp liên kết giữa pSn với PRRSV M / GP5 là sự tương tác giữa đầu N-terminal của pSn và axit sialic trên bề mặt GP5. CD163 Cụm biệt hóa phân biệt 163 (CD163) là một glycoprotein 130 kDa thuộc họ thụ thể giàu cystein  (scavenger receptor cystein-rich – SRCR) (Martinez và cộng sự, 2011). Không giống như Sn biểu hiện riêng biệt trên bề mặt tế bào của PAMs, CD163 có mặt trên bề mặt tế bào và trong các hạt nội bào sớm (early endosome), mặc dù cả Sn và CD163 chỉ biểu hiện giới hạn trong các dòng tế bào thực bào đơn nhân lớn như monocyte – macrophage (Van Gorp và cộng sự, 2010). Các phân tử với các lãnh vực SRCR được chia thành hai nhóm (nhóm A và B) theo vị trí và số lượng cysteine có trong từng lãnh vực. CD163 là một protein nhóm B SRCR (Van Gorp và cộng sự, 2010). CD163 là một protein ngoại bào, bao gồm một peptide tín hiệu tiếp theo là chín lãnh vực SRCR, một đoạn TM đơn và đuôi ngắn trong bào tương (Martinez và cộng sự, 2011). CD163 đã được xác định là thụ thể cho cả genotype I và genotype II PRRSV. Sự xâm nhiễm của PRRSV vào các tế bào thực bào monocyte đạt hiệu quả khi phối hợp tốt với sự gia tăng của CD163 (Wang và cộng sự, 2011a). Kết quả phân tích tế bào theo dòng chảy (Flow cytometry) cho thấy có sự tương quan trực tiếp giữa sự biểu hiện của CD163 trong tế bào PAMs và sự lây truyền của PRRSV (Wang và cộng sự, 2012.). CD163 cũng đã được chứng minh là một thụ thể trong việc xâm nhập của PRRSV vào tế bào Marc-145 mặc dù các tế bào này không thuộc dòng đại thực bào đơn nhân lớn (Monocyte – Macrophage) (Calvert và cộng sự, 2007). Các PAMs đã được xử lý trước với tetradecanoy phorbol acetate (TPA) hoặc lipopolysaccharide (LPS), kết quả cho thấy sự biểu hiện của CD163 đã giảm và sự xâm nhiễm PRRSV cũng giảm tương ứng theo (Gao và cộng sự, 2013). Kháng thể kháng CD163 ở lợn đã được chứng minh có khả năng ngăn chặn sự xâm nhiễm của PRRSV vào PAMs (Gao và cộng sự, 2013). Ngoài ra, sự điều chỉnh giảm biểu hiện CD163 thông qua việc bổ sung viRNA181 dẫn đến sự ức chế sự xâm nhập của PRRSV vào các PAMs và sau đó ngăn chặn sự nhiễm virus (Gao và cộng sự, 2013). Việc truyền nhiễm các dòng tế bào không hoạt động với PRRSV (ví dụ như BHK-21, dòng tế bào thận của lợn PK032495, các dòng tế bào thận của họ nhà mèo, NLFK, tế bào LLC-PK) với CD163 cDNA có nguồn gốc từ lợn, chó, chuột, con người và khỉ xanh châu Phi cho phép PRRSV xâm nhiễm và tái bản trong tế bào, điều này đã xác nhận đầy đủ vai trò của CD163 như một thụ thể của PRRSV (Calvert và cộng sự, 2007, Gao và cộng sự, 2013). Hơn nữa, bằng cách so sánh chức năng cơ bản của Sn, CD163 và các lực chung của chúng, CD163 đã được xác nhận chịu trách nhiệm về việc cởi bỏ lớp vỏ hạt virus và giải phóng bộ gen virus sau khi kết dính sớm trong suốt quá trình nhiễm PRRSV (Patton và cộng sự, 2009; Van Gorp và cộng sự, 2010 ).Các lãnh vực CD163 của lợn liên quan đến nhiễm PRRSV đã được xác định bằng các đột biến xóa và xây dựng cấu trúc hệ gene các mô. Đối với tầm quan trọng của các lãnh vực SRCR, các thí nghiệm đột biến xóa hay thay thế đã loại trừ sự cần thiết của bốn lần đầu lặp lại N-terminal (SRCR 1-4) và cho thấy rằng SRCR 5 là đầu lặp lại quan trọng cần cho sự nhiễm PRRSV vào tế bào (Calvert và cộng sự, 2007; Das et al. 2010, Gao và cộng sự, 2013). Đối với các C-terminal lặp lại (SRCR 6-9), chúng có thể được thay thế bằng các lặp lại tương ứng khác, chẳng hạn như CD163L1 của con người, mặc dù bốn lĩnh vực này là cần thiết (Calvert và cộng sự, 2007). CD163-L1 tương tự như CD163, nhưng không giúp cho PRRSV có thể nhiễm được vào tế bào (Van Gorp và cộng sự, 2010). Gần đây, (Calvert và các cộng sự, 2007) nhận thấy rằng thụ thể hòa tan SRCR59-Fc (các lãnh vực từ 5 đến 9 của CD163 lợn kết hợp với phần Fc cừu), nhưng không SRCR5Fc (chỉ lãnh vực 5 hợp nhất với Fc cấy lợn) có thể liên kết với các hạt PRRSV. Lãnh vực TM, được bảo tồn cao trong các loài, là một tính năng khác của protein CD163. Xóa bỏ và các thí nghiệm thay thế cho thấy rằng lãnh vực TM là cần thiết cho phép PRRSV xâm nhiễm. Tuy nhiên, trình tự TM của CD163 lợn có thể được thay thế CD163-L1 TM của người, và sự thay thế này không có ảnh hưởng đến sự lây nhiễm của PRRSV (Van Gorp và cộng sự, 2010). Các đuôi tế bào chất, khá bảo tồn giữa các loài, không phải là điều kiện cần thiết cho nhiễm PRRSV (Lee và Lee 2010). Ngược lại, đuôi đã được chứng minh là có tác động ức chế nhân bản PRRSV, bởi vì dòng tế bào BHK-21 được biểu hiện CD163 không có đuôi có thể sản sinh ra nhiều virus hơn so với các tế bào biểu hiện toàn bộ CD163  (Lee và Lee 2010).Trong quá trình PRRSV xâm nhập vào tế bào chủ cảm thụ, CD163 tương tác với các glycoprotein tiểu vỏ bao GP2a và GP4, thay vì các GP khác bao gồm cả GP5 (Das et al., 2011). Ở đây, các protein GP2a và GP4 đóng vai trò như các protein gắn kết virus. Protein GP2a hoặc GP4 có thể được kéo xuống bằng CD163 ΔTM, thiếu lãnh vực đầu carboxy bào tương; lãnh vực TM và 9 lãnh vực SRCR,  (Das et al. 2010). GP4 đã được tìm thấy đồng vị hoá với CD163 trong các mảng lipid (lipid rafts) và liên quan đến quá trình xâm nhập của PRRSV. GP4 virus là một protein màng biến đổi GPI, và lãnh vực đầu C của nó phục vụ như là tín hiệu điều chỉnh GPI. GP4 tồn tại dưới hai hình thức, một cấu trúc peptit neo kị nước (hydrophobic peptide-anchored) và một cấu trúc lipid neo GPI gắn với màng tế bào. Ngược lại với peptit neo GP4, dạng neo GPI có thể sẽ có ưu tiên tương tác với CD163 để thúc đẩy sự lây nhiễm PRRSV (Du và cộng sự, 2012). Không giống như GP4, GP2 là một protein màng tích hợp (integral membrane protein) loại I và gắn vào màng tế bào qua lãnh vực TM đầu C kỵ nước. Cả hai dạng GP2a, GP2a trưởng thành và protein GP2a glycosyl hoá một phần đều có thể tương tác với CD163. Cho đến nay, không có báo cáo về cách GP2 tương tác với thụ thể CD163 ảnh hưởng đến sự lây nhiễm PRRSV (Das và cộng sự, 2011).Lực liên kết của các thụ thểSự xâm nhiễm của PRRSV vào các tế bào đích là một quá trình tương tác giữa virus với các thụ thể trung gian. HS, Sn, CD163, CD151 và vimentin đã được xác định là các thụ thể quan trọng tham gia vào quá trình sinh bệnh như đã đề cập ở trên. Để đạt được sự xâm nhiễm hiệu quả, virus cần một vài thụ thể và các phân tử hữu ích khác của tế bào chủ trong quá trình xâm nhập. Trên thực tế, các thụ thể có thể hợp tác để thực hiện nhiều chức năng và thúc đẩy nhân rộng virus. Trong nhiễm PRRSV, HS và Sn được phát hiện là thụ thể thêm vào trong quá trình gắn virus, và các lực liên kết giữa Sn và CD163 đã được xác nhận. Hiểu được các lực liên kết giữa các thụ thể, ngay cả với các phân tử khác, rất có giá trị trong việc thiết kế vắc-xin; thuốc thử chống virus mới và để phát triển các dòng tế bào mới cho sản xuất vắc-xin; phân lập virus.Delputte et al. (2011) đã chứng minh rằng HS và Sn là hai thụ thể duy nhất tham gia vào PRRSV gắn kết thông qua các cơ chế khác nhau và đề xuất rằng hiệu quả của chúng là bổ sung cho nhau, vì gần như hoàn toàn (99%) ngăn chặn sự bám dính đã xảy ra khi dùng đồng thời cả hai loại kháng thể đơn dòng 41D3 chống heparin và Sn thêm vào trong quá trình gắn kết các chủng virus LV vào PAMs ở 4°C với nồng độ 2.500 μg heparin/ml và 10 μg mAb 41D3/ml. Bằng cách sử dụng tế bào CHO-K1 hoang dại  [Sn-, HS +] và các đột biến của nó không có HS biểu hiện, Delputte et al. (2005) cũng xác nhận rằng HS có thể làm tăng cường hấp thu PRRSV qua Sn trung gian, dẫn đến tăng nhiễm virus, mặc dù HS không được yêu cầu bởi Sn có vai trò như một thụ thể hấp thụ virus. Dựa trên các kết quả, họ đề xuất rằng PRRSV đầu tiên liên kết với thụ thể HS và sau đó thông qua thụ thể Sn giúp cho virus hấp thụ vào trong thông qua cơ chế thực bào clathrin trung gian (clathrin-mediated endocytosis) (Delputte và cộng sự, 2005, 2011). Sau đó, các lực liên kết Sn và CD163 đã được xác nhận trong quá trình xâm nhập của PRRSV vào các PAMs. Van Gorp et al. 2010 nhận thấy rằng đồng biểu hiện của Sn và CD163 trong các tế bào không cho phép có thể làm tăng sản xuất virus từ 10-100 lần so với các tế bào chỉ biểu hiện CD163. Sự kết hợp cả hai kháng thể chống lại Sn và CD163 có thể chặn đứng hoàn toàn sự lây nhiễm PRRSV vào PAMs trong khi đó nếu sử dụng một kháng thể đơn dòng chỉ làm giảm đến 75% sự lây nhiễm của virus (Van Gorp và cộng sự, 2010). Họ cũng gợi ý rằng trong quá trình nhiễm PRRSV vào PAMs, PRRSV được tiếp nhận và hấp thụ bởi thụ thể Sn; sau đó các hạt virus được cởi bỏ lớp vỏ bởi thụ thể CD163.  Điều thú vị là virus PRRSV độc lực cao subtype 3 thuộc chủng Châu Âu  (Lena) đã được khẳng định là có lượng tế bào thích nghi  rộng hơn;  nó cũng có thể tái bản trong các tế bào chỉ biểu hiện CD163+ Sn–  và ở một mức độ thấp hơn trong các tế bào không biểu hiện cả CD163 và Sn, trong khi đó virus PRRS subtype 1 chủng (LV) chỉ lây nhiễm vào các đại thực bào có biểu hiện cả CD163+  Sn+ (Frydas và cộng sự, 2013). Bằng cách sử dụng hệ thống nuôi cấy mô niêm mạc mũi phân cực, Frydas et al.  (2013) phát hiện ra rằng 97% tế bào dương tính với  virus PRRSV chủng LV là các tế bào CD163 + Sn + nằm trong màng mô liên kết (propria lamina) nằm dưới của mô liên kết lỏng lẻo của màng nhầy, trong khi đó chủng Lena xâm nhiễm cả tế bào CD163+ Sn+ và CD163+ Sn– (hơn 50%) nằm trong hoặc gần với biểu mô để có thể tiếp cận các phần sâu của niêm mạc. Khả năng Lena sao chép trong các tế bào Sn âm tính cho thấy rằng Lena có thể sử dụng một thụ thể bổ sung cho mục đích xâm nhập của virus hoặc điều chỉnh tăng các phân tử bám dính đặc hiệu thúc đẩy sự lây lan của virus lan rộng.Sự hợp tác của các thụ thể PRRSV có thể được khai thác để phát triển các dòng tế bào mới cho sản xuất vắc xin hoặc phân lập virus và thuốc thử chống virus mới. Delrue et al. (2010) đã xây dựng các dòng tế bào cảm thụ để cho phép PRRSV xâm nhiễm và phân lập virus bằng cách chuyển nhiễm các gene Sn và CD163 vào tế bào không cảm thụ PRRSV. Các dòng tế bào PK-15 và CHO-K1 không cho phép lây nhiễm PRRSV. Tuy nhiên, PK15 Sn-CD163 và CHO Sn-CD163, dạng tái tổ hợp của PK-15 và CHO biểu hiện các thụ thể PRRSV Sn và CD163 đã trở nên nhạy cảm với sự nhiễm virus và có thể gia tăng số lượng PRRSV khi gắn kết thành công, hấp thụ và giải phóng các hạt virus (Delrue et al 2010). Dòng tế bào PK15 Sn-CD163, nhìn chung tốt hơn so với CHO Sn-CD163, có thể tạo ra mức độ virus tương tự nhau của tất cả năm chủng PRRSV bao gồm LV và VR-2332 so với các tế bào Marc-145. So với các tế bào Marc-145 không có biểu hiện Sn, các dòng tế bào tái tổ hợp có thể bắt chước PAMs với Sn để duy trì sự tăng trưởng của PRRSV. Điều quan trọng là sản xuất vacxin tương đồng virus tự nhiên. Cùng với nhau, các dòng tế bào tái tổ hợp có thể được sử dụng như một phương pháp thay thế cho việc sản xuất vaccin PRRSV và phân lập virus (Delrue et al., 2010).Kết luậnHS, biểu hiện trên bề mặt tế bào của cả hai tế bào Marc-145 và PAMs, đóng vai trò như một thụ thể PRRSV cho sự gắn kết, chứ không phải đối với sự xâm nhập. HS có thể làm tăng hấp thụ virus qua Sn trung gian, mặc dù biểu hiện của nó là không cần thiết. Sn, hạn chế biểu hiện trên bề mặt PAMs, nhưng không có trong MA-104 và các dẫn xuất của nó bao gồm Marc-145 và CL-2621, có chức năng như một thụ thể hấp thụ PRRSV, một mình Sn có thể là thụ thể trung gian giúp cho  gắn kết virut và hấp thụ, nhưng không giúp cho cởi bỏ lớp vỏ của các  hạt virus. Phức hợp liên kết disulfide M / GP5 chịu trách nhiệm cho việc kết hợp gữa PRRSV với các thụ thể HS và Sn. Đầu N-terminal globulin miễn dịch (N-terminal 150 amino axit) của Sn được yêu cầu để kết hợp với axit sialic trên bề mặt của protein GP5. CD163, biểu hiện trong PAMs và Marc145 và hiện diện cả trên bề mặt tế bào và trong các hạt nội bào sớm (early endosomes), có liên quan đến sự xâm nhập của PRRSV, có thể là trong suốt quá  trình cởi bỏ lớp vỏ của các hạt virus, nhưng không có vai trò trong hấp thụ. Các lãnh vực SRCR 5-9 của CD163 là cần thiết, và SRCR5 có vai trò quan trọng đối với quá trình xâm nhiễm PRRSV. CD163 tương tác với các tiểu phần vỏ bao glycoprotein GP2a và GP4, thay vì các GP khác bao gồm GP5 chủ yếu. CD151, được thể hiện trong tất cả các dòng tế bào cho phép PRRSV, bao gồm các PAMs, MA-104 và các dẫn xuất của nó và các tế bào SJPG, nhưng không ở các dòng tế bào không cho phép, chẳng hạn như BHK-21 và MDBK, là một thụ thể PRRSV. CD151 được đề xuất tham gia vào sự kết hợp giữa lớp vỏ virus và hạt nội bào (endosome) hoặc để khu trú lại các phức hợp ribonucleoprotein để thúc đẩy quá trình nhân bản của virus thông qua tương tác với PRRSV  3′ UTR RNA. Ngoài ra, vimentin, thành phần phổ biến nhất của IF, là một phần của phức hợp thụ thể PRRSV và trung gian vận chuyển PRRSV vào trong bào tương qua sự tương tác với protein nucleocapsid của virus. Đến nay, các dòng tế bào duy trì sự tái bản của PRRSV trong ống nghiệm có thể được chia thành ba loại. Một là các dòng monocyte-macrophage bao gồm cả PAMs và các monocytes máu ngoại vi đã xử lý trước với alpha interferon để tăng cường nhiễm virus. Một loại khác là tế bào thận khỉ châu Phi MA-104 và các dẫn xuất của nó bao gồm Marc-145, Vero và CL-2621. Thứ ba l à các dòng tế bào tái tổ hợp cho phép PRRSV nhân lên được tạo ra từ các tế bào ban đầu không mẫn cảm, các tế bào này trở nên nhạy cảm với nhiễm virus sau khi biểu hiện thụ thể tương ứng. Ví dụ, BHK-21 đã được truyền nhiễm bằng CD163, CD151 hoặc vimentin cDNA, các tế bào thận lợn được tái tổ hợp biểu hiện một mình Sn, CD163, CD151 hoặc cả Sn và CD163, và dạng tái tổ hợp CHO Sn-CD163 được tạo ra khi CHO-K1 biểu hiện Sn và CD163 với nhau. Khi có sự khác nhau về biểu hiện thụ thể, PAMs và Marc-145 trải qua con đường khác nhau để gắn PRRSV, hấp thụ và cởi vỏ. PAM biểu hiện HS, Sn, CD163, CD151 và vimentin. PRRSV đầu tiên gắn với PAMs thông qua HS, và sau đó, virus được hấp thụ thông qua Sn. CD163 có thể tham gia vào giai đoạn tháo gỡ virus. CD151 và vimentin cũng có thể tham gia nhiễm PRRSV của PAM, nhưng vai trò của chúng trong quá trình này vẫn còn chưa rõ ràng. Tế bào Marc-145 thể hiện HS, CD163, CD151 và vimentin, nhưng không biểu hiện Sn. PRRSV đầu tiên liên kết với các tế bào Marc-145 thông qua HS. Vimentin được đề xuất để trung gian vận chuyển PRRSV tới bào tương qua sự tương tác với nucleocapsid của virus. CD151 được gợi ý là trung của sự kết hợp giữa virus và các hạt nội bào. CD163 có thể tham gia vào quá trình cởi vỏ virus. Cùng với nhau, các thí nghiệm bổ sung là cần thiết để minh họa các tương tác giữa các thụ thể và PRRSV mặc dù đã có những nghiên cứu sâu rộng để phân tích chức năng của thụ thể trong quá trình nhiễm PRRSV trên các tế bào đích. Hiểu rõ hơn cơ chế chính xác sẽ tạo điều kiện cho việc thiết kế các thuốc thử chống vi rút mới và các dòng tế bào mới cho sản xuất vắc-xin và phân lập virus. Tài liệu tham khảo
  1. Calvert JG, Slade DE, Shields SL, Jolie R, Mannan RM, Ankenbauer RG, Welch SK (2007) CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses. J Virol 81:7371–7379. doi:10.1128/jvi.00513-07
  2. Chen Y, Guo R, He S, Zhang X, Xia X, Sun H (2014) Additive inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection with the soluble sialoadhesin and CD163 receptors. Virus Res 179:85–92. doi:10.1016/j.virusres.2013.11.008
Crocker PR, Kelm S, Dubois C, Martin B, McWilliam AS, et al. (1991) Purification and properties of sialoadhesin, a sialic acid-binding receptor of murine tissue macrophages. Embo J 10: 1661–1669. Crocker PR, Varki A (2001) Siglecs in the immune system. Immunology 103:137–145.  
  1. Das PB, Dinh PX, Ansari IH, de Lima M, Osorio FA, Pattnaik AK (2010) The minor envelope glycoproteins GP2a and GP4 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus interact with the receptor CD163. J Virol 84:1731–1740. doi:10.1128/jvi.01774-09
  2. Das PB, Vu HL, Dinh PX, Cooney JL, Kwon B, Osorio FA, Pattnaik AK (2011) Glycosylation of minor envelope glycoproteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infectious virus recovery, receptor interaction, and immune response. Virology 410:385–394. doi:10.1016/j.virol.2010.12.002
  3. Delputte PL, Costers S, Nauwynck HJ (2005) Analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus attachment and internalization: distinctive roles for heparan sulphate and sialoadhesin. J Gen Virol 86:1441–1445. doi:10.1099/vir.0.80675-0
  4. Delputte PL, Van Gorp H, Favoreel HW, Hoebeke I, Delrue I, Dewerchin H, Verdonck F, Verhasselt B, Cox E, Nauwynck HJ (2011) Porcine sialoadhesin (CD169/Siglec-1) is an endocytic receptor that allows targeted delivery of toxins and antigens to macrophages. PLoS One 6:e16827. doi:10.1371/journal. pone.0016827
  5. Delrue I, Van Gorp H, Van Doorsselaere J, Delputte PL, Nauwynck HJ (2010) Susceptible cell lines for the production of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by stable transfection of sialoadhesin and CD163. BMC Biotechnol 10:48. doi:10.1186/1472-6750-10-48
  6. Dokland T (2010) The structural biology of PRRSV. Virus Res 154:86–97. doi:10.1016/j.virusres.2010.07.029
  7. Du Y, Pattnaik AK, Song C, Yoo D, Li G (2012) Glycosyl-phosphatidylinositol (GPI)-anchored membrane association of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP4 glycoprotein and its co-localization with CD163 in lipid rafts. Virology 424:18–32. doi:10.1016/j.virol.2011.12.009
  8. Durocher JR, Payne RC, Conrad ME (1975) Role of sialic acid in erythrocyte survival. Blood 45:11–20 Fitter S, Sincock PM, Jolliffe CN, Ashman LK (1999) Transmembrane 4 superfamily protein CD151 (PETA-3) associates with beta 1 and alpha IIb beta 3 integrins in haemopoietic cell lines and modulates cell-cell adhesion. Biochem J 338(Pt 1):61–70
  9. Frydas IS, Verbeeck M, Cao J, Nauwynck HJ (2013) Replication characteristics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) European subtype 1 (Lelystad) and subtype 3 (Lena) strains in nasal mucosa and cells of the monocytic lineage: indications for the use of new receptors of PRRSV (Lena). Vet Res 44:73. doi:10.1186/1297-9716-44-73
  10. Gao L, Guo XK, Wang L, Zhang Q, Li N, Chen XX, Wang Y, Feng WH (2013) MicroRNA 181 suppresses porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection by targeting PRRSV receptor CD163. J Virol 87:8808–8812. doi:10.1128/ jvi.00718-13
Hartnell A, Steel J, Turley H, Jones M, Jackson DG, et al. (2001) Characterization of human sialoadhesin, a sialic acid binding receptor expressed by resident and inflammatory macrophage populations. Blood 97: 288–296.
  1. Jiang Y, Khan FA, Pandupuspitasari NS, Kadariya I, Cheng Z, Ren Y, Chen X, Zhou A, Yang L, Kong D, Zhang S (2013) Analysis of the binding sites of porcine sialoadhesin receptor with PRRSV. Int J Mol Sci 14:23955–23979. doi:10.3390/ijms141223955
  2. Johnson CR, Griggs TF, Gnanandarajah J, Murtaugh MP (2011) Novel structural protein in porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by an alternative ORF5 present in all arteriviruses. J Gen Virol 92:1107–1116. doi:10.1099/ vir.0.030213-0
  3. Kim HS, Kwang J, Yoon IJ, Joo HS, Frey ML (1993) Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line. Arch Virol 133:477–483
  4. Lee YJ, Lee C (2010) Deletion of the cytoplasmic domain of CD163 enhances porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication. Arch Virol 155:1319–1323. doi:10.1007/ s00705-010-0699-8
  5. Martinez VG, Moestrup SK, Holmskov U, Mollenhauer J, Lozano F (2011) The conserved scavenger receptor cysteine-rich superfamily in therapy and diagnosis. Pharmacol Rev 63:967–1000. doi:10.1124/pr.111.004523
  6. Martinez-Pomares L, Gordon S (2012) CD169 + macrophages at the crossroads of antigen presentation. Trends Immunol 33:66–70. doi:10.1016/j.it.2011.11.001
  7. Meulenberg JJ, Petersen-den Besten A (1996) Identification and characterization of a sixth structural protein of Lelystad virus: the glycoprotein GP2 encoded by ORF2 is incorporated in virus particles. Virology 225:44–51
  8. Meulenberg JJ, Petersen-den Besten A, De Kluyver EP, Moormann RJ, Schaaper WM, Wensvoort G (1995) Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus. Virology 206:155–163
  9. Nieuwenhuis N, Duinhof TF, van Nes A (2012) Economic analysis of outbreaks of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in nine sow herds. Vet Rec 170:225. doi:10.1136/vr.100101
  10. O’Neill AS, van den Berg TK, Mullen GE (2013) Sialoadhesin—a macrophage-restricted marker of immunoregulation and inflammation. Immunology 138:198–207. doi:10.1111/imm.12042
O’Reilly MK, Paulson JC (2009) Siglecs as targets for therapy in immune-cellmediated disease. Trends Pharmacol Sci 30: 240–248.  
  1. Patton JB, Rowland RR, Yoo D, Chang KO (2009) Modulation of CD163 receptor expression and replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in porcine macrophages. Virus Res 140:161–171. doi:10.1016/j.virusres.2008.12.002
Peter L. Delputte , Hanne Van Gorp1, Herman W. Favoreel, Inge Hoebeke , Iris Delrue , Hannah Dewerchin , Frank Verdonck, Bruno Verhasselt , Eric Cox , Hans J. Nauwynck (2011). Porcine Sialoadhesin (CD169/Siglec-1) Is an Endocytic Receptor that Allows Targeted Delivery of Toxins and Antigens to Macrophages. . PLoS ONE 6(2): e16827. doi:10.1371/journal.pone.0016827  
  1. Prather RS, Rowland RR, Ewen C, Trible B, Kerrigan M, Bawa B, Teson JM, Mao J, Lee K, Samuel MS, Whitworth KM, Murphy CN, Egen T, Green JA (2013) An intact sialoadhesin (Sn/
SIGLEC1/CD169) is not required for attachment/internalization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 87:9538–9546. doi:10.1128/jvi.00177-13
  1. Robinson SR, Figueiredo MC, Abrahante JE, Murtaugh MP (2013) Immune response to ORF5a protein immunization is not protective against porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Vet Microbiol 164:281–285. doi:10.1016/j.vetmic.2013.03.006
  2. Van Breedam W, Verbeeck M, Christiaens I, Van Gorp H, Nauwynck HJ (2013) Porcine, murine and human sialoadhesin (Sn/Siglec-1/ CD169): portals for porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into target cells. J Gen Virol 94:1955–1960. doi:10.1099/vir.0.053082-0
  3. Van Gorp H, Van Breedam W, Van Doorsselaere J, Delputte PL, Nauwynck HJ (2010) Identification of the CD163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 84:3101–3105. doi:10.1128/jvi.02093-09
  4. Vanderheijden N et al (2003) Involvement of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages. J Virol 77:8207–8215
  5. Wang L, Zhang H, Suo X, Zheng S, Feng WH (2011a) Increase of CD163 but not sialoadhesin on cultured peripheral blood monocytes is coordinated with enhanced susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Vet Immunol Immunopathol 141:209–220. doi:10.1016/j.vetimm.2011.03.001
  6. Wang F, Qiu H, Zhang Q, Peng Z, Liu B (2012) Association of two porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) receptor genes, CD163 and SN with immune traits. Mol Biol Rep 39:3971–3976. doi:10.1007/s11033-011-1177-4
  7. Welch SK, Calvert JG (2010) A brief review of CD163 and its role in PRRSV infection. Virus Res 154:98–103. doi:10.1016/j. virusres.2010.07.018.

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *