Phát triển phương pháp LAMP kết hợp sử dụng chỉ thị màu kép trong chẩn đoán phát hiện virus gây tiêu chảy cấp ở lợn

Giới thiệu: Dịch tiêu chảy cấp tính trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea – PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do virus thuộc họ Coronaviridae gây ra, với các triệu chứng lâm sàng đặc trưng là nôn mửa, tiêu chảy và mất nước. Dịch PED xảy ra ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ chết cao ở lợn con dưới 7 ngày tuổi (90-100%). Trong các phương pháp chẩn đoán PED virus (PEDV) hiện tại, LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) là một phương pháp chẩn đoán đẳng nhiệt đặc hiệu, đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm. Tuy nhiên, các phương pháp đánh giá kết quả của các phản ứng LAMP hiện tại là tốn thời gian và tăng nguy cơ tạp nhiễm cho các phản ứng tiến hành sau đó.

Mục đích nghiên cứu: Phát triển phương pháp LAMP đơn giản trong chẩn đoán phát hiện PEDV bằng mắt thường bằng việc bổ sung thêm chỉ thị màu kép trước khi tiến hành phản ứng.

Phương pháp nghiên cứu: PEDV chủng phân lập Q3/Q5 được sử dụng để kiểm tra giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP so với phương pháp PCR. 91 mẫu phân lợn nghi mắc PED được thu thập, xử lý, chiết tách ARN và dùng làm khuôn mẫu cho cả phản ứng RT-PCR và RT-LAMP. Với phản ứng RT-LAMP chỉ cần bổ sung thêm 1µl chỉ thị màu kép vào thành phần phản ứng trước khi tiến hành để giúp cho quá trình đọc kết quả bằng mắt thường.

Kết quả: Sử dụng chỉ thị kép bao gồm GelGreen và HNB bổ sung vào thành phần phản ứng LAMP, kết quả có thể đọc theo hai cách: (1) sự thay đổi màu của chỉ thị màu kim loại HNB, dung dịch chuyển màu xanh lam là phản ứng dương tính, phản ứng âm tính là vẫn giữ nguyên màu tím của HNB. (2) quan sát dưới đèn tím ống phát sáng màu xanh lục là kết quả dương tính, ống âm tính phát sáng màu đỏ cam. Kết quả xét nghiệm từ 91 mẫu thực địa cho thấy đây là một phương pháp nhân gen đẳng nhiệt nhanh, đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và kết quả của phản ứng có thể dễ dàng đánh giá bằng mắt thường.

Kết luận: Bổ sung thêm chỉ thị màu kép vào thành phần phản ứng phương pháp RT-LAMP trước khi khuếch đại là một giải pháp ổn định và hiệu quả về chi phí, có những ưu điểm vượt trội hơn so với các phương pháp đọc kết quả hiện tại, tránh tạp nhiễm cho các phản ứng sau đó. Đây là một phương pháp nhân gen đẳng nhiệt nhanh, nhạy và đơn giản và kết quả của phản ứng có thể dễ dàng đánh giá bằng mắt thường. Do đó, kết quả nghiên cứu của chúng tôi có tính ứng dụng cao trong công tác chẩn đoán nhanh PEDV cũng như các tác nhân gây bệnh khác.

Từ khóa: Phương pháp LAMP, PEDV, chỉ thị màu kép, RT-PCR

Mai Thị Ngân¹, Nguyễn Văn Giáp¹, Cao Thị Bích Phượng¹, Huỳnh Thị Mỹ Lệ¹, Satoshi Sekiguchi²

¹Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

²Khoa Nông nghiệp, Đại học Miyazaki, Nhật Bản

Email: mtngan@vnua.edu.vn