Trương Quang Lâm, Đào Lê Anh, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Thu Hằng
Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Canine Parvovirus (CPV) là bệnh truyền nhiễm cao và thường gây tử vong cao ở chó, đặc biệt chó con dưới 1 năm tuổi. Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu phân lập CPV trên môi trường tế bào MDCK (Madin darby canine kidney), tế bào dòng CRFK (J. W. Frost et al., 1984; Mohan Raj, J., 2010) và xác định đặc tính sinh học của CPV. Kumar và cộng sự (2003) đã phân lập 25 mẫu bệnh phẩm trên môi trường tế bào dòng MDCK và kết quả cho thấy 9 mẫu có bệnh tích tế bào (Cytopathogenic effect – CPE). Những nghiên cứu gần đây, có tác giả cũng sử dụng môi trường tế bào dòng này để phân lập nuôi cấy CPV cho nhiều mục đích sản xuất chế phẩm sinh học để phòng và trị bệnh (Shikun Ge., 2020). Tại Việt Nam, những nghiên cứu về CPV gây bệnh trên chó còn rất hạn chế, cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu nào về phân lập các chủng CPV gây bệnh tại thực địa trên môi trường tế bào dòng. Nhận thấy sự cần thiết nghiên cứu phát triển chế phẩm điều trị và vacxin phòng bệnh do CPV trên chó từ chính các chủng virus thực địa, chúng tôi đặt vấn đề thực hiện nghiên cứu phân lập Canine parvo virus (CPV) trên môi trường tế bào dòng nhằm lựa chọn được môi trường phân lập virus Parvo đạt hiệu quả cao; đồng thời làm rõ đặc tính sinh học của các chủng CPV gây bệnh tại thực địa trên môi trường tế bào thích hợp. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần làm cơ sở cho việc chọn chủng CPV có đặc tính sinh học phù hợp dùng để chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng trong chẩn đoán, chế phẩm sinh học ứng dụng trong điều trị và phát triển vacxin phòng bệnh hiệu quả.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1.Thu thập mẫu:
Swab trực tràng (n = 56) được lấy trong dung dịch PBS (pH 7,2) từ chó có triệu chứng lâm sàng: sốt, tiêu chảy, nôn và được kiểm tra dương tính với CPV bằng phương pháp PCR từ các phòng khám thú y chó mèo tại tỉnh Thái Bình, tỉnh Hà Nam, Hải Dương từ tháng 8 năm 2019 đến tháng 2 năm 2020.
2.2. Phân lập CPV trên môi trường tế bào dòng CRFK và MDCK. Hàng ngày theo dõi sự phá huỷ tế bào bằng kính hiển vi soi nổi và thu lại virus khi tế bào bị phá hủy đạt 80% – 90%. Nếu không thấy xuất hiện bệnh tích thì thu lại virus sau 96 giờ gây nhiễm và gây nhiễm lại lần nữa để kiểm tra bệnh tích.
2.3. Xác định hiệu giá virus TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose) được xác định theo phương pháp của Reed-Muench.
2.4.Phản ứng PCR
Cặp mồi được sử dụng: forc (Forward primer): 5′- AAAGAGAGCCAGGAGAGGTA -3′; revc (Reverse primer): 5′- TTCTGACAGCAGGTTGACCA -3′ (Seon Ah Park và cs., 2012).
2..5. Giải trình tự gene và xây dựng cây sinh học phân tử
Dữ liệu trình tự gene thu được từ máy giải trình tự gene được xử lý bằng phần mềm MEGA X (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 10).
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập CPV trên môi trường tế bào dòng MDCK và CRFK.
Kết quả phân lập CPV trên hai môi trường này thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1. Kết quả phân lập CPV trên hai môi trường tế bào MDCK và CRFK
| Môi trường phân lập | Số mẫu virus phân lập | Số mẫu có bệnh tích tế bào | Tỷ lệ (%) | Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt CPV | Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt virus khác |
| MDCK | 56 | 7 | 12,50 | 7/7 mẫu dương tính | 2/7 mẫu dương tính |
| CRFK | 56 | 4 | 7,14 | 4/4 mẫu dương tính | 4/4 mẫu âm tính |
Bảng 2. Thông tin các chủng Canine Parvo virus
| STT | Ký hiệu mẫu | Giống chó | Tháng tuổi | Tính biệt | Địa điểm thu thập | Ký hiệu chủng virus |
| 1 | TB017 | Bec lai | 5 | Cái | Thái Bình | VNUA CPV TB017 |
| 2 | HD005 | Poodle | 4 |
Đực |
Hải Dương | VNUA CPV HD005 |
| 3 | HD101 | Vàng | 4 | Đực | Hải Dương | VNUA CPV HD101 |
| 4 | HD119 | Poodle | 9 | Đực | Hải Dương | VNUA CPV HD119 |
Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR tương ứng với một phần đoạn gen VP2 của các chủng phân lập CPV cho thấy các chủng phân lập VNUA CPV TB017, VNUA CPV HD005, VNUA CPV HD101 và VNUA CPV HD119 thuộc genotype CPV2c, và tương đồng 100% nucleotide với các chủng CPV2c được công bố trước đây tại Việt Nam (2013-2017), Trung quốc năm 2017 (CN/AH1705 strain) và các chủng tham chiếu trên thế giới (Hình 4).
3.2. Khả năng gây bệnh tích tế bào của CPV
Bảng 3. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng CPV
(tính theo % diện tích tế bào bị phá hủy so với tổng số diện tích đáy bình nuôi cấy)
| Chủng virus | CPE theo thời gian sau khi gây nhiễm virus (%) | ||||||
| 24hpi | 36hpi | 48hpi | 60hpi | 72hpi | 84hpi | 96hpi | |
| VNUA CPV TB017 | – | * | 20 | 50 | 80 | 100 | B |
| VNUA CPV HD005 | – | 10 | 50 | 70 | 90 | B | |
| VNUA CPV HD101 | – | * | 30 | 50 | 80 | 100 | B |
| VNUA CPV HD119 | – | 10 | 40 | 65 | 85 | B | |
*: CPE dưới 5%
10%: số % tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích bề mặt nuôi cấy
B: Tế bào bong tróc hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy
hpi: hour post inoculation (giờ sau gây nhiễm virus)
Phân lập thành công 04 mẫu CPV trên dòng tế bào CRFK, đây là dòng tế bào phù hợp với nuôi cấy virus CPV gây bệnh tại 3 tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả đời thứ 2 có 04 mẫu virus đã gây bệnh tích tế bào. Gây nhiễm virus Parvo từ đời thứ 5 đến thứ 7, thấy virus gây bệnh tích tế bào từ 36 giờ đến 48 giờ sau khi gây nhiễm và phá hủy hoàn toàn tế bào sau 72 giờ đến 84 giờ. Kết quả 04 chủng virus Parvo có hiệu giá cao (6,67×105 – 3,16×107 TCID50/25µl), chứng tỏ virus Parvo có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào CRFK.
Liên kết bài báo trên Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, số 4 năm 2021: https://vjol.info.vn/index.php/kk-ty/article/view/67764.
English