Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Thu Hằng, Lê Thị Dung, Nguyễn Hồng Thái, Hoàng Cảnh Lâm, Trần Thị Vân Anh
Khoa thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
TÓM TẮT
Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) được ứng dụng để kiểm tra sự có mặt của virus viêm não Nhật Bản (VNNB) trong các mẫu huyết thanh lợn thu thập trên địa bàn huyện Gia Lâm, Thành phố Hà Nội và để tìm hiểu vai trò của lợn trong chu trình truyền bệnh trong tự nhiên. Kết quả nghiên cứu 80 mẫu huyết thanh lợn thu thập được cho thấy tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính với VNNB là 6,25% (5/80 mẫu). Trình tự nucleotide của đoạn gen prM của các chủng virus VNNB nghiên cứu có kích thước là 563 bp và mức độ tương đồng của chúng với nhau là 99,29% – 99,82%, và mức độ tương đồng về acid amin của các chủng dao động từ 98,27% – 100,0%. 5 chủng virus VNNB nghiên cứu có cùng nguồn gốc phát sinh với các chủng virus viêm não Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc đã phân lập trước đây và thuộc về genotype 1. Kết quả của nghiên cứu này đã góp phần chỉ ra tình hình nhiễm bệnh VNNB trên lợn ở huyện Gia Lâm, Hà Nội, và đưa ra biện pháp phòng, khống chế có hiệu quả bệnh VNNB ở lợn.
Từ khóa: Lợn, Viêm não Nhật Bản, RT-PCR, Hà Nội
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở Việt Nam, chăn nuôi lợn là một trong những ngành quan trọng hàng đầu cung cấp nguồn thực phẩm cho xã hội. Tuy nhiên, bên cạnh sự phát triển về số lượng và quy mô thì ngành chăn nuôi lợn đang phải liên tục đối mặt với các bệnh dịch nguy hiểm như: lở mồm long móng, hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản,… gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cũng như cho phát triển chăn nuôi lợn ở nước ta. Bên cạnh đó có rất nhiều bệnh truyền lây nguy hiểm giữa lợn và người như: bệnh xoắn khuẩn, bệnh viêm não Nhật Bản, bệnh trực cầu khuẩn,… Trong đó, virus viêm não Nhật Bản (VNNB) là một trong số virus gây viêm não lây truyền qua muỗi, nguy hiểm nhất trên người. Hằng năm, trên thế giới ước tính có từ 30000 – 50000 trường hợp mắc, trong đó có 10000 – 15000 ca chết (Ghosh và cs., 2009; Saxena, 2008). Viêm não do virus VNNB đặc biệt quan trọng vì thường là viêm não cấp, tỷ lệ tử vong có thể lên đến 30% và khoảng 50% bệnh nhân sống sót bị di chứng thần kinh. Ở nước ta, từ năm 1960 bệnh có chiều hướng gia tăng và trở thành một vấn đề nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng (Đỗ Quang Hà và cs., 1994). Ở Việt Nam, các ca viêm não trên người thường ở dạng viêm não cấp tính, và ở miền Nam Việt Nam có 1,9 ca mắc trong 100.000 người trong giai đoạn 1998 – 2007, với tỷ lệ trung bình các ca tử vong là 6,4% (Yen NT và cs., 2010). Do tính chất nguy hiểm nên bệnh không chỉ là mối quan tâm lớn của Ngành Y tế mà đối với cả Ngành Thú y… Bệnh viêm não Nhật Bản là bệnh truyền lây từ động vật sang người do Flavivirus gây ra. Trong tự nhiên, virus được duy trì và truyền lây qua chu trình bao gồm muỗi (chủ yếu là muỗi Culex), chim và động vật có vú. Lợn được coi là động vật cảm nhiễm cao nhất và là ký chủ chính cho sự nhân lên của virus VNNB. Ở những vùng có bệnh lưu hành, virus gây rối loạn sinh sản (chết phôi, thai khô, thai chết và vô sinh) trên lợn.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu – Mẫu máu của lợn nghi nhiễm VNNB được lấy ở các xã Phù Đổng, Dương Xá, Lệ Chi, Trâu Quỳ, Dương Quang thuộc địa bàn huyện Gia Lâm. – Hóa chất cho phản ứng RT – PCR: Kít tách chiết RNA tổng số (Qiagen), kít dùng cho phản ứng RT-PCR,.. – Các trang thiết bị, máy móc khác phục vụ cho nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
2.2. Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp lấy mẫu máu lợn: Những lợn trong các trang trại và nông hộ chăn nuôi được đánh số ngẫu nhiên, được tiến hành lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ, sau đó đưa về phòng thí nghiệm để chắt huyết thanh và bảo quản ở -200 C trước khi xét nghiệm. – Phương pháp RT-PCR: RNA của virus được tách chiết bằng kit QIAamp để tiến hành phản ứng RT- PCR. Quy trình tách chiết RNA của virus theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit. Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR gồm mồi xuôi và mồi ngược nhằm khuếch đại đoạn gen prM dài 600 bp theo nghiên cứu của Hồ Thị Việt Thu và Phan Thị Ngà (2012). – Kỹ thuật giải trình tự gen: Sử dụng cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngược) để giải trình tự gen prM của virus JEV bằng máy giải trình tự gen tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) tại Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH, Khoa Thú y. Kết quả thu được xử lý bằng phần mềm Seq 8000. Blast, Ngân hàng gen (GenBank) (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov) và xử lý kết quả bằng MEGA6 và gentyx version 5.0. – Phân tích, xây dựng cây sinh học phân tử: Từ các trình tự gen prM, chúng tôi tiến hành truy cập Ngân hàng gen để có thông tin gen prM của các chủng virus tham chiếu và tiến hành so sánh đặc điểm di truyền và thiết lập cây sinh học phân tử bằng phần mềm MEGA6.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hồ sơ mẫu sử dụng trong nghiên cứu
Nghiên cứu đã tiến hành thu thập các mẫu máu lợn từ 5 xã trên địa bàn huyện Gia Lâm, sau đó được chắt huyết thanh và bảo quản ở -20o C tại Phòng thí nghiệm. Các thông tin về nguồn gốc các mẫu máu được ghi chép và hệ thống lại. Các mẫu huyết thanh được lấy ngẫu nhiên từ các nhóm lợn riêng biệt ở nhiều độ tuổi khác nhau. Và những lợn này đều chưa được tiêm phòng vacxin phòng bệnh viêm não Nhật Bản.
3.2. Tình hình nhiễm bệnh VNNB trên lợn theo địa bàn các xã nghiên cứu
Từ các mẫu huyết thanh thu thập được, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự có mặt của virus VNNB bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu với gen prM của virus VNNB. Kết quả các mẫu huyết thanh được chẩn đoán dương tính bằng phản ứng RT-PCR của các xã nghiên cứu.
Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm VNNB ở các xã nghiên cứu Phù Đổng, Dương Xá, Trâu Quỳ., Lệ Chi, Dương Quang chiếm 5/80 mẫu (6,25%). Riêng ở 3 xã Phù Đổng, Dương Xá và Trâu Quỳ, không có mẫu huyết thanh nào có mặt của virus VNNB. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với nghiên cứu của Hồ Thị Việt Thu và cộng sự (2008) khi chỉ ra tỷ lệ dương tính với virus VNNB là 8,33% ở các mẫu não thu thập từ heo con, thai sẩy, thai chết lưu tại An Giang và Vĩnh Long.
3.3. Tình hình nhiễm bệnh theo hình thức chăn nuôi
Các mẫu huyết thanh được thu thập từ các đàn lợn được chăn nuôi theo các quy mô khác nhau được chẩn đoán bằng phương pháp RT- PCR. Từ kết quả thấy có sự sai khác giữa hai hình thức chăn nuôi quy mô hộ gia đình và trang trại. Trong đó, chăn nuôi quy mô trang trại có tỷ lệ dương tính với virus VNNB thấp hơn so với chăn nuôi quy mô hộ gia đình. Điều này có thể được lý giải là do các trang trại chăn nuôi lợn thường có công tác vệ sinh thú y phòng bệnh, diệt trừ ruồi muỗi cũng như thiết kế chuồng nuôi đảm bảo về nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, mật độ đàn nuôi hợp lý nên giúp hạn chế tỷ lệ mắc bệnh VNNB so với lợn được chăn nuôi theo hộ gia đình. Trong nghiên cứu của Hồ Thị Việt Thu và cộng sự (2008) đã chỉ ra các yếu tố như bụi rậm (nơi trú ẩn của muỗi Culex), môi trường có nhiều ao nước tù đọng (nơi sinh sản của muỗi Culex) cũng có thể là yếu tố quan trọng làm tăng nguy cơ nhiễm virus VNNB. Điều này giúp giải thích cho kết quả nghiên cứu của chúng tôi khi tỷ lệ nhiễm bệnh VNNB ở trang trại thấp hơn ở hộ chăn nuôi.
3.4. Kết quả giải trình tự gen của các chủng virus VNNB
Từ 5 mẫu huyết thanh được chẩn đoán dương tính bằng RT-PCR. Chúng tôi tiến hành đặt tên cho các chủng virus VNNB (Japanese encephalitis virus – JEV) tương ứng lần lượt là VNUA_Vetlab_JEV01, VNUA_Vetlab_JEV02, VNUA_Vetlab_JEV03, VNUA_Vetlab_JEV04, VNUA_Vetlab_JEV05. Việc giải trình tự gen được thực hiện trên máy giải trình tự tự động Beckman Coulter CEQ 8000 tại phòng thí nghiệm. Trình tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm Seq 8000 và gentyx version 5.0 trên máy tính cho kết quả đoạn gen dài 563 bp. Trình tự nucleotide của 5 chủng virus VNNB đã được khẳng định chính xác lại bằng việc tham chiếu từ Ngân hàng gen thông qua chương trình Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa các chủng virus VNNB nghiên cứu
Cùng với việc thực hiện giải trình tự gen prM của 5 chủng nghiên cứu, chúng tôi đồng thời tiến hành so sánh trình tự nucleotide để xác định mức độ tương đồng về nucleotide giữa các chủng virus VNNB; từ đó thấy được mức độ biến đổi về thành phần nucleotide cũng như thấy được mối quan hệ cụ thể giữa các chủng virus VNNB đang lưu hành ở huyện Gia Lâm. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của 5 chủng nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm gentyx version 5.0. Từ quá trình so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen prM của 5 chủng VNNB trong nghiên cứu có độ dài 563 bp, kết quả cho thấy trong thành phần nucleotide của các chủng virus này đã có sự sai khác nhau tương đối và có 5 vị trí nucleotide sai khác nhau.
3.6. Sự tương đồng về nucleotide trong đoạn gen prM của các chủng virus VNNB nghiên cứu
Từ kết quả giải trình tự đoạn gen prM của các chủng virus VNNB nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thu thập và xử lý bằng chương trình MEGA6 để so sánh mức độ tương đồng về nucleotide giữa các chủng nghiên cứu và tham chiếu với chủng virus VNNB được phân lập ở Trung Quốc (JN381850), Việt Nam (U3696). Kết quả cho thấy 5 chủng virus VNNB nghiên cứu có mức độ tương đồng về nucleotide đạt tỷ lệ khá cao, từ 99,29% đến 99,82%. Sự tương đồng về nucleotide giữa 5 chủng VNNB nghiên cứu với chủng VNNB ở Sài Gòn (U3696) đạt tỷ lệ dao động trong khoảng 87,92% đến 88,10%. VNNB ở Trung Quốc (JN381850) cho mức độ dao động trong khoảng từ 97,16% đến 97,34%. Điều này cho thấy sự gần gũi trong mối quan hệ di truyền giữa 5 chủng VNNB tìm được ở huyện Gia Lâm với chủng VNNB phân lập được tại Trung Quốc.
IV. KẾT LUẬN
Bằng phương pháp RT-PCR đã chỉ ra tỷ lệ nhiễm VNNB ở các xã nghiên cứu chiếm 6,25%. Trình tự nucleotide của đoạn gen prM của các chủng virus VNNB nghiên cứu có kích thước 563 bp và tương đồng với nhau khoảng 99,29% đến 99,82%; mức độ tương đồng về acid amin dao động từ 98,27% đến 100,0%. 5 chủng virus VNNB nghiên cứu có cùng nguồn gốc phát sinh với các chủng Nhật Bản (1998, 2003), Hàn Quốc (1999) và các chủng Trung Quốc (2007, 2008, 2011) và đều thuộc genotype 1.
Link bài báo: TẠP CHÍ KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIII SỐ 2 – 2016
https://vjol.info.vn/index.php/kk-ty/article/view/35955
English