CẤU TẠO, SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

CẤU TẠO, SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm

Mục đích: giúp sinh viên hiểu cấu tạo và biết cách sử dụng kính hiển vi để nghiên cứu vi sinh vật.

VSV vô cùng nhỏ bé, không thể nhìn bằng mắt thường. Kể từ năm 1674 khi Anton Van Leeuwenhoek lần đầu tiên phát minh ra kính hiển vi (KHV) cho đến nay đã có rất nhiều loại KHV hiện đại ra đời. KHV là một dụng cụ quang học rất cần thiết để nghiên cứu VSV. Kính gồm có nhiều lăng kính với các độ phóng đại khác nhau, có tác dụng làm tăng góc trông ảnh của những vật rất nhỏ mà ta không thể nhìn thấy được bằng mắt thường.

Có 2 loại KHV chính là KHV quang học (light microscope) và KHV điện tử (electron microscope). KHV quang học sử dụng ánh sáng trong khi đó KHV điện tử sử dụng hạt điện tử để chiếu sáng. KHV quang học được sử dụng phổ biến trong các PTN trong khi đó KHV điện tử được dùng để quan sát những vật vô cùng nhỏ bé như virus hoặc cấu tạo dưới tế bào.

Trong mỗi một loại KHV lại được chia thành nhiều nhóm. Ví dụ: KHV quang học có KHV nền sáng, KHV nền tối, KHV soi ngược, KHV huỳnh quang; KHV điện tử có KHV quét hoặc KHV truyền qua (scanning hoặc transmission).

1. Cấu tạo Kính hiển vi quang học

            KHV gồm 4 hệ thống:

– Hệ thống giá đỡ (support system)

– Hệ thống phóng đại (lens system)

– Hệ thống chiếu sáng (light system)

– Hệ thống điều chỉnh (focusing system)

Cả 4 hệ thống kết hợp với nhau tạo nên hình ảnh phóng to của mẫu vật.

Thị kính Bàn xoay gắn vật kính Vật kính Ốc vĩ cấp Ốc vi cấp Bàn kính (giá đựng mẫu vật) Hệ thống đèn, gương… tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật. Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật. Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phần khác nhau theo ý muốn.

Hình 1.1. Kính hiển vi quang học

1. Hệ thống giá đỡ

Hệ thống này bao gồm: bệ (chân kính hay đế kính), thân, bàn xoay gắn vật kính, bàn để tiêu bản, kẹp tiêu bản;

Bệ và thân dùng để đỡ các bộ phận của KHV;

Bàn kính (khay kính hay đĩa kính) để giữ tiêu bản, ở giữa có lỗ hổng để ánh sáng có thể chiếu vào phiến kính. Tiêu bản có thể được đặt dưới 2 cái kẹp lò xo và di chuyển bằng ngón tay, hoặc được giữ bằng bàn kính cơ học và di chuyển bằng ốc điều khiển.

1. Hệ thống phóng đại

            Gồm thị kính và vật kính

– Thị kính (ocular lens): là 1 bộ phận của KHV mà người ta để mắt và để soi kính, có 2 loại ống đôi và ống đơn. Bản chất là một thấu kính hội tụ có tiêu cự rất ngắn, dùng để tạo ra ảnh thật của vật cần quan sát.

Thị kính gồm có 2 thấu kính lắp vào hai đầu của một cái ống nhỏ lắp trên đầu ống kính: một thấu kính hướng về mắt người xem và một thấu kính hướng về vật quan sát. Kính trên là kính phóng đại ảnh thật do vật kính thu được, kính dưới là kính thị trường làm sáng tỏ thị trường do đó mà ta nhìn thấy rõ ảnh được phóng đại.

Thị kính có độ phóng đại càng cao thì khoảng cách giữa 2 thấu kính càng ngắn và ngược lại. Thị kính thường có 4 số: × 5, × 7, × 10, × 15; trong đó × 10 là phổ biến.

– Vật kính: là 1 bộ phận của KHV quay về phía có vật mà người ta muốn quan sát. Có 3 độ phóng đại chính của vật kính: độ phóng đại thấp (low-power objective), thường × 10; độ phóng đại trung bình (high-dry objective), thường × 40 hoặc × 45; và vật kính dầu (oil immersion objective) có độ phóng đại cao, thường × 97 đến 100.

Bản chất là một thấu kính, nó trực tiếp phóng đại ảnh thật của tiêu bản. Khả năng phóng đại của vật kính phụ thuộc vào bán kính cong của thấu kính: thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng đại càng lớn.

Có 2 loại vật kính:

+ Vật kính khô: là vật kính có số bội giác thấp (× 8, × 40) dùng để xem tươi, xem vi khuẩn di động, xem khuẩn lạc, xem ký sinh trùng hoặc xem tiêu bản tổ chức;

+ Vật kính dầu: là vật kính có bội giác cao (× 100), có một vòng đen ở đầu vật kính để phân biệt với vật kính khô. Vật kính dầu dùng để quan sát tế bào vi khuẩn, bạch cầu,…

Vật kính khô và vật kính dầu khác nhau ở chất mà ánh sáng phải đi qua tiêu bản. Ở vật kính khô, chất đi qua là không khí mà chỉ số khúc xạ (chiết xuất) là n = 1 rất khác với chỉ số khúc xạ của thủy tinh n = 1,52; do đó các tia sáng khi đi ra khỏi tiêu bản sẽ bị phản xạ và phần ngoài của chùm ánh sáng không lọt được vào vật kính.

Tuy nhiên, khi độ phóng đại càng lớn thì thấu kính phải càng nhỏ. Khi sử dụng vật kính có độ phóng đại lớn thì chỉ có một phần tia sáng rất nhỏ lọt vào thấu kính của vật kính, vì vậy ảnh nhận được sẽ không rõ lắm. Để tránh điều này người ta dùng một loại dầu (dầu bạch hương) có chiết xuất xấp xỉ với chiết xuất của thủy tinh n = 1,51 đặt vào giữa tiêu bản và vật kính. Lúc này thủy tinh và dầu bạch hương là một môi trường gần như đồng nhất, ánh sáng khi đi qua thủy tinh sẽ không bị khúc xạ mà chiếu thẳng vào vật kính.

Để biết được độ phóng đại của kính hiển vi, chỉ việc nhân độ phóng đại của thị kính với độ phóng đại của vật kính đã dùng.

1. Hệ thống chiếu sáng

– Nguồn sáng (gương hoặc đèn): đặt ở phía dưới khay kính dùng để lấy ánh sáng;

– Màn chắn (bộ phận chắn sáng): hình con ngươi, được đặt vào trong tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng đi qua tụ quang;

– Tụ quang kính, dùng để tập trung những tia ánh sáng và hướng luồng ánh sáng vào tiêu bản cần quan sát. Vị trí của tụ quang nằm ở giữa gương và bàn để tiêu bản. Di chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu.

1. Hệ thống điều chỉnh

– Ốc vĩ cấp (ốc điều chỉnh lớn), dùng để điều chỉnh tiêu điểm;

– Ốc vi cấp (ốc điều chỉnh nhỏ), khi vặn làm ống kính di chuyển rất chậm;

– Ốc điều chỉnh tụ quang lên xuống;

– Ốc điều chỉnh độ tập trung ánh sáng của tụ quang;

– Núm điều chỉnh màn chắn;

– Ốc di chuyển phiến kính mang tiêu bản (trước, sau, trái, phải);

2. Cách sử dụng kính hiển vi quang học

– Đặt kính lên trên bàn cho ngay ngắn, ở tư thế có lợi nhất cho người quan sát;

– Đặt tiêu bản lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản

– Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp;

– Điều chỉnh ánh sáng;

– Điều chỉnh tụ quang: đối với vật kính × 10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính × 40 để tụ quang ở đoạn giữa, vật kính ×100 lên cao nhất;

– Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính;

– Để xem vật kính dầu, trước hết phải tập trung ảnh ở vật kính thấp trước (× 40), sau đó quay sang vật kính dầu;

– Nhỏ 1 giọt dầu soi để soi chìm trên phiến kính khi soi vật kính x100;

– Hạ vật kính sát vào tiêu bản (mắt nhìn tiêu bản).

– Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vĩ cấp để đưa vật kính lên cho đến khi nhìn thấy hình ảnh mờ của vi trường;

–  Điều chỉnh ốc vi cấp để được hình ảnh rõ nét;

– Sau khi xem xong, phải lau sạch vật kính bằng giấy lau chuyên dụng. Tuyệt đối không được để cồn dây sang các vật kính khác; nếu có dây sang phải lau thật sạch ngay.

3. Bảo quản kính hiển vi

– Sử dụng và bảo quản kính hiển vi một cách thận trọng. Khi dùng xong luôn phải rút phích điện ra khỏi ổ cắm;

– Đặt kính ở nơi khô thoáng, vào cuối ngày làm việc đặt kính hiển vi vào hộp có gói hút ẩm silicagel để trách bị mốc. Đậy kính bằng khăn tối màu che bụi và che ánh sáng;

– Lau hệ thống giá đỡ hàng ngày bằng khăn lau sạch, lau vật kính dầu bằng giấy mềm chuyên dụng có tẩm xylen hoặc cồn;

– Định kỳ bảo dưỡng, mở kính lau hệ thống chiếu sáng phía trong;

– Kính ở trạng thái nghỉ: xoay các bộ phận của kính về đúng chỗ quy định, không để vật kính nằm trong trục kính như lúc quan sát mà phải xoay vật kính ra 2 bên và vặn sát xuống đĩa kính, tụ quang hạ thấp xuống, đóng chắn sáng.

* Quản lý thiết bị

– Phải có người phụ trách kỹ thuật và trang thiết bị: hiểu rõ về nguyên lý cũng như cách sử dụng kính hiển vi, chịu trách nhiệm về tình trạng của kính;

– Có sổ theo dõi sử dụng kính hiển vi: ghi ngày, giờ sử dụng; mẫu quan sát; người sử dụng; tình trạng của kính trước và sau khi sử dụng;

– Khi kính hiển vi có sự cố phải thông báo ngay với cấp trên và liên hệ sửa chữa, bảo dưỡng với kỹ sư đại diện ở Việt Nam của hãng sản xuất kính;

– Khi kính hiển vi bị hỏng không thể khắc phục, phải báo với bộ phận có thẩm quyền để thanh lý thiết bị theo quy định, không tự ý thanh lý thiết bị.