Nguyễn Văn Giáp, Cao Thị Bích Phượng, Lê Văn Trường, Trương Thái Hà, Chu Thị Thanh Hương, Đặng Hữu Anh, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Luyến, Huỳnh Thị Mỹ Lệ – Bộ môn Vi sinh vật và Bệnh truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Tính cấp thiết: Bệnh hô hấp là một trong những nhóm bệnh quan trọng nhất trên gia cầm, gây ảnh hưởng rõ rệt đến sức khỏe vật nuôi, làm tăng tỷ lệ mắc bệnh và chết, giảm tăng trọng cũng như giảm năng suất trứng. Các tác nhân gây bệnh đường hô hấp ở gia cầm rất đa dạng, bao gồm virus, vi khuẩn, mycoplasma và nấm; trong thực tế, nhiễm ghép nhiều tác nhân xảy ra khá phổ biến, khiến việc chẩn đoán trở nên phức tạp hơn. Trong số đó, virus viêm thanh khí quản truyền nhiễm (Infectious laryngotracheitis virus – ILTV) là tác nhân quan trọng gây bệnh đường hô hấp trên ở gà, còn Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) là vi khuẩn hô hấp mới nổi, ngày càng được ghi nhận với vai trò đáng kể trong hội chứng hô hấp ở gia cầm. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có quy trình multiplex PCR trên gel phù hợp để phát hiện đồng thời ILTV và ORT. Vì vậy, việc xây dựng một phương pháp duplex PCR có độ đặc hiệu, độ nhạy cao và dễ áp dụng trong phòng thí nghiệm là cần thiết, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán, giám sát và kiểm soát bệnh hô hấp trên gà.
Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện nhằm xây dựng và tối ưu hóa một phương pháp duplex PCR để phát hiện đồng thời ILTV và ORT trong mẫu bệnh phẩm hô hấp của gà, từ đó bổ sung công cụ chẩn đoán nhanh đối với các trường hợp nhiễm đơn và nhiễm ghép.
Cụ thể, các mục tiêu nghiên cứu bao gồm:
- Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu thích hợp cho phản ứng multiplex PCR đối với ILTV và ORT.
- Xác định các điều kiện phản ứng tối ưu, bao gồm nhiệt độ bắt cặp và nồng độ mồi, nhằm bảo đảm sự khuếch đại đồng thời và ổn định của hai đoạn gen đích.
- Đánh giá độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của phương pháp duplex PCR đã xây dựng.
- Ứng dụng phương pháp trên mẫu thực địa thu thập từ các đàn gà có biểu hiện bệnh hô hấp và xác nhận kết quả bằng giải trình tự Sanger.
Thông qua đó, nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát hiện đồng thời hai tác nhân hô hấp quan trọng trên gà, phục vụ công tác chẩn đoán, giám sát dịch tễ học và hỗ trợ xây dựng biện pháp phòng bệnh hiệu quả.
Kết quả nghiên cứu
3.1. Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR
Kết quả cho thấy cặp mồi thiết kế cho ILTV tạo sản phẩm khuếch đại có kích thước 233 bp, trong khi cặp mồi đặc hiệu cho ORT tạo sản phẩm 467 bp.
Khi khảo sát dải nhiệt độ bắt cặp từ 55 đến 65°C, cả hai băng đặc hiệu đều được ghi nhận; tuy nhiên, tại 65°C, các băng khuếch đại rõ, sáng và ổn định nhất, do đó đây được xác định là nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng duplex PCR. Đối với nồng độ mồi, trong 16 tổ hợp được thử nghiệm, nồng độ ban đầu 2,5 pmol/µL cho mỗi cặp mồi cho kết quả cân bằng nhất giữa hai mục tiêu, với băng đặc hiệu rõ nét và hầu như không xuất hiện sản phẩm phụ không đặc hiệu.
3.2. Độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của phương pháp Multiplex PCR
Khi đánh giá với sáu tác nhân hô hấp không đích thường gặp ở gà, gồm virus đậu gà (FWPV), Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Avibacterium paragallinarum, Avian pathogenic Escherichia coli và Pasteurella multocida, phản ứng Multiplex PCR không tạo băng khuếch đại không đặc hiệu tại vị trí 233bp hoặc 467bp. Ngược lại, khi có mặt DNA của ILTV và/hoặc ORT, phản ứng chỉ xuất hiện đúng các băng đích tương ứng, chứng tỏ bộ mồi có tính đặc hiệu cao. Về độ nhạy, giới hạn phát hiện của phương pháp đạt tới mức 10^3 bản sao DNA/µL đối với cả hai tác nhân; cụ thể, ILTV được phát hiện ở mức 3,92 × 10^3 copies/µL và ORT ở mức 2,18 × 10^3 copies/µL. Nghiên cứu cũng ghi nhận rằng số chu kỳ nhiệt ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng, trong đó phản ứng 50 chu kỳ nhạy hơn khoảng 10 lần so với phản ứng 35 chu kỳ.
3.3. Ứng dụng phương pháp trên mẫu thực địa
Phản ứng duplex PCR đã được áp dụng để sàng lọc 304 mẫu bệnh phẩm hô hấp thu thập từ các đàn gà có biểu hiện bệnh hô hấp tại 15 tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam. Kết quả cho thấy 23 mẫu dương tính đồng thời với cả ILTV và ORT, 88 mẫu chỉ dương tính với ILTV và 44 mẫu chỉ dương tính với ORT. Tỷ lệ dương tính chung tương ứng là 36,5% đối với ILTV và 22,0% đối với ORT. Một số mẫu xuất hiện băng phụ không đặc hiệu, nhưng các băng này khác kích thước với sản phẩm đích nên không ảnh hưởng đến việc diễn giải kết quả. Các amplicon dương tính được chọn ngẫu nhiên để giải trình tự Sanger, và kết quả so sánh BLAST xác nhận các đoạn khuếch đại 233 bp và 467 bp đúng là trình tự của ILTV và ORT. Những kết quả này khẳng định phương pháp duplex PCR mới xây dựng có khả năng nhận diện hiệu quả cả nhiễm đơn và nhiễm ghép trong điều kiện thực tế, phù hợp sử dụng trong chẩn đoán các tác nhân hô hấp trên gà.
Nguồn: Dịch và biên soạn từ bài báo “A Multiplex PCR Method for Simultaneous Detection of Infectious Laryngotracheitis Virus and Ornithobacterium rhinotracheale”, Veterinary Sciences, 2023, 10, 272. Link: https://doi.org/10.3390/vetsci10040272
English