Tính cấp thiết
Trong những năm gần đây, việc sử dụng động vật làm mô hình nghiên cứu y sinh và bệnh trên người đang thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới. Trong đó, các nghiên cứu sử dụng lợn làm mô hình thử nghiệm ngày càng tăng nhờ có sự tương đồng lớn với con người về giải phẫu cũng như sinh lý học. Đây là thuận lợi để có thể nghiên cứu các công nghệ như tế bào gốc, kỹ thuật cấy ghép mô hay công nghệ protein tái tổ hợp trên lợn. Hơn nữa, ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, công nghệ gen và công nghệ phôi để tạo lợn biến đổi gen có giá trị lớn trong nghiên cứu bệnh trên người. Do đó, lợn được coi là một trong những mô hình động vật có giá trị để cung cấp nguồn tế bào và cơ quan thích hợp cho cấy ghép mô cũng như động vật chuyển gen để tạo ra các protein đặc biệt liên quan đến y sinh học trên người. Mặt khác, lợn là nguồn thực phẩm chính cung cấp protein cũng như chất béo nên ngành chăn nuôi lợn đang rất phát triển trên nhiều quốc gia trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Tạo phôi trong ống nghiệm (IVP) ở động vật có vú cũng như trên lợn bao gồm ba kỹ thuật chính: (i) Sự trưởng thành trong ống nghiệm (IVM) của noãn bào được phục hồi trực tiếp từ nang trứng, (ii) Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) và (iii) Nuôi cấy in vitro (IVC) của hợp tử cho đến giai đoạn phôi nang. Trong đó, IVM là bước đầu tiên có vai trò quyết định đến kết quả tạo phôi lợn trong ống nghiệm. Ở giai đoạn này, tận dụng những tế bào trứng lợn chưa thành thục thu được từ nang trứng trên buồng trứng sau đó nuôi tế bào trứng đến giai đoạn trưởng thành rồi đưa vào thụ tinh trong ống nghiệm hoặc sử dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyên sâu khác như nhân bản vô tính hay vi tiêm tinh. Vì vậy, quá trình nuôi thành thục tế bào trứng không những cần thiết cho sự thành công của quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi mà còn là nguồn cung cấp nguyên liệu nghiên cứu quan trọng.
Mục đích nghiên cứu:
Nghiên cứu này nhằm xác định tỷ lệ thành thục trứng, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ hình thành phôi nang của trứng được nuôi thành thục trong môi trường POM pha từ 2 nguồn nước Sigma hoặc MQW. Việc lựa chọn môi trường nuôi thành thục tối ưu là điều kiện tiên quyết dẫn đến sự thành công trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn cũng như các công nghệ hỗ trợ sinh sản khác như nhân bản vô tính, vi tiêm tinh (ICSI) hay chỉnh sửa gen, từ đó phục vụ cho các nghiên cứu y sinh trên người.
Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1. Ảnh hưởng của nguồn nước sử dụng pha môi trường đến khả năng thành thục và phát triển của phôi lợn
a. Ảnh hưởng của nguồn nước sử dụng pha môi trường nuôi trưởng thành đến khả năng thành thục của trứng lợn nuôi cấy in vitro
Tế bào trứng thu được sẽ được nuôi trưởng thành trong môi trường POM trong đĩa cấy bốn giếng trong thời gian từ 20 – 22 giờ. Sau đó, trứng được cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy không chứa dbcAMP trong 24 giờ. Hoặc môi trường POM sử dụng nước cất hai lần được lọc qua máy lọc nước khử ion (mQ water) trong đĩa cấy bốn trong thời gian từ 20 – 22 giờ. Sau đó, trứng được cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy không chứa dbcAMP trong 24 giờ. Quá trình nuôi trưởng thành trứng sẽ được tiến hành trong tủ nuôi 5% CO2 ở 38.50C, độ ẩm không khí bão hòa. Sau thời gian nuôi cấy, trứng được tách sạch tế bào cumulus và nhuộm bằng thuốc nhuộm Orcein và kiểm tra dưới kính hiển vi soi ngược để xác định giai đoạn phát triển của nhân, qua đó đánh giá tỷ lệ thành thục của trứng. Dựa trên kết quả đạt được để xác định môi trường nuôi trứng tối ưu.
b.Ảnh hưởng của nguồn nước pha môi trường nuôi trưởng thành đến tỷ lệ thụ tinh của trứng lợn nuôi cấy in vitro
Tế bào trứng sau khi nuôi trưởng thành được thụ tinh trong ống nghiệm sử dụng tinh lợn Bản đông lạnh. Tinh trùng được giải đông và rửa bằng cách ly tâm trong dung dịch TCM 199, pH 7.8. Khoảng 10 µl tinh trùng đã được làm ấm sẽ được pha loãng trong 90 µl môi trường thụ tinh (Pig – FM) có chứa khoảng 30 trứng đã nuôi thành thục. Nồng độ tinh trùng được điều chỉnh ở mức 1x 106/ml. Quá trình này được tiến hành trong tủ cấy 5% O2 ở 38.50C. Sau 18-22 giờ tính từ thời điểm thụ tinh, hợp tử được tách sạch tế bào cumulus và được nhuộm bằng thuốc nhuộm Orcein (Sigma) và kiểm tra dưới kính hiển vi soi ngược để xác định giai đoạn tiền nhân đực và tiền nhân cái của hợp tử, qua đó đánh giá tỷ lệ thụ tinh. Dựa trên kết quả đạt được để xác định môi trường nuôi trứng tối ưu.
c. Ảnh hưởng của nguồn nước pha môi trường nuôi trưởng thành đến tỷ lệ hình thành phôi nang của trứng lợn nuôi cấy in vitro
Sau khi tiến hành quá trình thụ tinh cho các tế bào trứng, các tế bào trứng được nuôi cấy trong tủ cấy 5% O2 ở 38.50C. Các tế bào cumulus sau đó được tách ra khỏi tế bào trứng, hợp tử được chuyển sang môi trường nuôi cấy phôi PZM3 trong đĩa cấy bốn giếng ở điều kiện 5% O2 ở 38.50C cho đến ngày thứ 7 (ngày thụ tinh là ngày 0) để đánh giá khả năng phát triển của phôi. Sau đó phôi được nhuộm bằng thuốc nhuộm Hoechst 33342 (Sigma), từ đó đánh giá tỷ lệ phôi nang.
Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ phôi nang được sử dụng làm các chỉ tiêu đánh giá khả năng phát triển của trứng và chất lượng phôi.
2.2.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung hormone eCG và hCG trong môi trường nuôi thành thục trứng đến khả năng thành thục và phát triển của trứng sau thụ tinh ống nghiệm
a. Ảnh hưởng của việc bổ sung hormone trong môi trường nuôi thành thục đến khả năng thành thục của trứng lợn nuôi cấy in vitro
Hormone đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phát triển và thành thục của tế bào trứng. Hormone gồm eCG và hCG có nhiệm vụ giúp tế bào trứng phát triển và kích thích tế bào trứng thành thục sẵn sàng cho quá trình thụ tinh. Vì vậy, chúng tôi tiến hành so sánh tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trong môi trường POM bổ sung hormone trong 22 giờ đầu hoặc môi trường POM bổ sung hormone trong 46 giờ. Tế bào trứng thu được sẽ được nuôi trưởng thành trong môi trường POM theo mô tả ở trên. Cụ thể, tế bào trứng được nuôi trong môi trường POM trong đĩa cấy bốn giếng trong thời gian từ 20 – 22 giờ. Sau đó, lô trứng số 1 được cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy không chứa dbcAMP trong 24 giờ. Lô trứng số 2 được cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy không chứa dbcAMP, EGF và hormone trong 24 giờ. Quá trình nuôi trưởng thành trứng sẽ được tiến hành trong tủ nuôi 5% CO2 ở 38.50C, độ ẩm không khí bão hòa. Sau thời gian nuôi cấy, trứng được tách sạch tế bào cumulus và nhuộm bằng thuốc nhuộm Orcein và kiểm tra dưới kính hiển vi soi ngược để xác định giai đoạn phát triển của nhân, qua đó đánh giá tỷ lệ thành thục của trứng.
b. Ảnh hưởng của việc bổ sung hormone trong môi trường nuôi thành thục trứng đến tỷ lệ thụ tinh của trứng lợn nuôi cấy in vitro
Tế bào trứng sau đó được thụ tinh trong ống nghiệm và đánh giá theo phương pháp mô tả ở trên.
c. Ảnh hưởng của việc bổ sung hormone trong môi trường nuôi thành thục trứng đến tỷ lệ hình thành phôi nang của trứng lợn nuôi cấy in vitro
Sau khi tiến hành quá trình thụ tinh cho các tế bào trứng, các tế bào trứng được nuôi cấy trong tủ cấy và đánh giá tỷ lệ phôi nang theo mô tả ở trên.
Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ phôi nang được sử dụng làm các chỉ tiêu đánh giá khả năng phát triển của trứng và chất lượng phôi
Kết quả chính:
Kết quả của chúng tôi cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ thành thục trứng, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ hình thành phôi nang của trứng được nuôi thành thục trong môi trường POM pha từ 2 nguồn nước Sigma hoặc MQW.
Môi trường POM bổ sung hormone trong 22 giờ đầu nuôi cấy cho tỷ lệ thành thục cao hơn so với môi trường bổ sung hormone trong 46 giờ nuôi cấy, tuy nhiên không có sự khác biệt về tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ phôi nang giữa hai nhóm thí nghiệm.
Kết luận:
Vậy có thể sử dụng nước khử ion tự sản xuất tại phòng thí nghiệm làm nguồn nước pha môi trường POM để tiết kiệm kinh phí. Đồng thời, việc bổ sung hormone trong 22 giờ đầu vẫn đảm bảo hiệu quả tạo phôi đồng thời tiết kiệm kinh phí.
Từ khóa: porcine embryos, maturity, fertilized
Link bài báo: https://tapchi.vnua.edu.vn/so-7-2020/
Bảng 1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng nguồn nước pha môi trường nuôi thành thục trứng lợn in vitro đến khả năng thành thục của trứng
| Nguồn nước pha Môi trường POM | Tổng số
tế bào trứng |
Số tế bào trứng chín (tỷ lệ thành thục%) |
| Nước Sigma | 125 | 110 (87.16±4.74) |
| Nước MQW | 128 | 106 (83.20±6.93) |
Số lần nhắc lại thí nghiệm n = 4
Bảng 2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng nguồn nước pha môi trường nuôi thành thục in vitro đến khả năng thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi nang của trứng lợn
| Nguồn nước pha Môi trường POM | Tổng số
tế bào trứng |
Số tế bào trứng được thụ tinh (tỷ lệ thụ tinh%) | Số phôi nang (tỷ lệ phôi nang %) |
| Nước Sigma | 191 | 111 (58.3 3.7) | 11 (5.7 0.4) |
| Nước MQW | 201 | 124 (61.8 4.1) | 19 (9.5 2.0) |
Số lần nhắc lại thí nghiệm n = 5, p>0.05
Bảng 3. Ảnh hưởng của việc bổ sung hormone trong môi trường nuôi thành thục trứng lợn in vitro đến khả năng thành thục của trứng
| Môi trường nuôi thành thục |
Tổng số tế bào trứng | Số tế bào trứng chín (tỷ lệ thành thục%) |
| Hormone trong 46 giờ | 153 | 131 (84.93±2.78) a |
| Hormone trong 22 giờ đầu | 184 | 168 (90.88±2.33) b |
Số lần nhắc lại thí nghiệm n = 4
Bảng 4. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung hormone trong môi trường nuôi thành thục in vitro đến khả năng thụ tinh và tỷ lệ hình thành phôi nang của trứng lợn
| Môi trường nuôi thành thục |
Tổng số tế bào trứng | Số tế bào trứng được thụ tinh
(tỷ lệ thụ tinh%) |
Số phôi nang
(tỷ lệ phôi nang %) |
| Hormone trong 46 giờ | 198 | 159 (80,3 2,8) | 26 (13,2 3,3) |
| Hormone trong 22 giờ đầu | 196 | 142 (72,3 3,4) | 31 (15,8 1,5) |
Số lần nhắc lại thí nghiệm n = 5, p>0,05
Đỗ Thị Kim Lành1*, Nguyễn Thị Ngọc Anh1 , Kazuhiro Kikuchi2 , Takeshige Otoi3 , Nguyễn Văn Thành1
1Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
2Viện nghiên cứu NARO, Nhật Bản
3Đại học Tokushima, Nhật Bản
English